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为获取鸭甲肝病毒3D基因的表达蛋白，研究其在鸭体免疫保护能力，以期为抗病毒新药开发提供基础数据及方向，为临床生产提供指导以防制该疾病的流行开展本课题。 本课题根据本实验室提交的甲型鸭肝炎序列及NCBI上3D基因的参考序列设计一对引物（P1:5-GGGGTACCGATCAAGGGAAAGTAGTGAGCAAG-3（KpnⅠ）; P2:5-ACGCCTCGAGTCAGATCATCATGCAAGCTGT-3(XhoⅠ)，通过RT-PCR及PCR扩增获取3D基因的全长片段。将纯化的3D基因片段T克隆至pJET-1.2载体，以PCR及酶切消化对重组质粒进行鉴定。将T克隆鉴定正确的基因片段克隆至pET-32(a)+表达载体，构建重组表达质粒。优化诱导表达的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度，表达温度以及时间，筛选3D蛋白可溶性表达的最佳条件。结果显示3D基因被成功扩增，成功构建重组表达质粒pET-32(a)+/DHAV-H-3D，获取了3D蛋白的最佳表达条件为0.8 mmol/L IPTG25℃诱导6h，表达蛋白的分子量为68 kD，将表达的蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹检测鉴定正确。按照最优条件大量表达3D蛋白，将获取的3D蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化后经SDS-PAGE分析鉴定，其浓度约1.5 mg/mL。 将纯化的3D蛋白与弗氏佐剂乳化均匀，按照免疫程序免疫成年公兔，制备高免血清。将鸭甲肝病毒接种鸡胚，获取尿囊毒，免疫1月龄鸭，制备鸭甲肝病毒阳性血清。另将病毒液纯化，获取纯化病毒。分别以3D蛋白、纯化的鸭肝炎病毒为抗原包被酶标条，通过对包被条件、封闭条件、抗体孵育条件、酶标抗体孵育条件及显色时间等的优化，分别建立基于3D蛋白、鸭甲肝病毒的ELISA检测方法。结果显示制备的兔抗3D血清琼扩效价为1∶8，制备的鸭甲肝病毒阳性血清经ELISA测定为阳性(P/N≥2.1)。得到以3D蛋白为抗原的ELISA最优检测条件为以1μg/mL的3D蛋白液4℃包被过夜，以1％ BSA作为封闭液37℃封闭0.5 h，血清1∶400稀释于37℃孵育1.5 h，HRP标记的羊抗鸭IgG以1∶800稀释，于37℃孵育0.5 h，显色15 min为最佳检测条件，确定阳性阈值为0.238。鸭肝炎病毒为抗原的ELISA抗体检测最佳条件为以1.125μg/mL蛋白浓度4℃包被过夜，以5％明胶37℃封闭0.5 h，血清1∶100稀释于37℃孵育1h，HRP标记的羊抗鸭IgG以1∶200稀释于37℃孵育1h，显色10 min，确定阳性阈值为0.143。建立的两种ELISA方法具有良好的特异性、重复性及灵敏度，并且两种方法检测的符合率为84.5％。 将纯化的3D蛋白与弗氏完全佐剂等量混合免疫1日龄雏鸭（P组），每只鸭皮下多点注射0.1 mg蛋白，同时设置蛋白与疫苗共同免疫组（P+V组）、疫苗组（V组）及空白对照组（C组）;P+V组每只鸭注射0.05 mg蛋白与1羽份的疫苗的混合物;V组每只鸭注射1羽份疫苗，对照组注射0.5 mL生理盐水。分别于免疫后3、7、14、21d采血，分别测定3D蛋白及鸭甲肝病毒ELISA抗体，以及IL-2、IL-4、IL-10、CD4+、CD8+、IFN-α、IFN-γ等7种免疫水平指标。于11日龄攻毒，将21日龄后存活的雏鸭处死后采集肝脏做免疫组织化学检测，观察3D蛋白在肝脏内的分布。结果显示3D蛋白免疫雏鸭后，细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、CD4+、CD8+、IFN-α、IFN-γ均呈现出持续上升趋势，于14日龄达到最高，随后至21日龄有所下降，3D蛋白与疫苗共同免疫组与疫苗组也是相似结果，对照组呈现较平稳趋势，但3D蛋白与疫苗共同免疫组的免疫因子水平较其他实验组高。抗体检测发现3D抗体、鸭肝炎病毒抗体均在免疫后3天可检测出，3D抗体在第7天无法检出，而鸭肝炎抗体呈现上升趋势。鸭甲肝病毒强毒株人工感染后，P组存活3只鸭，P+V组及V组雏鸭均全部存活，未免疫攻毒对照组全部死亡。P组存活鸭及P+V组、V组的3D蛋白抗体及病毒抗体水平达到最高水平，至21日龄有所下降。能检出抗体的时间点中，3D蛋白与疫苗共同免疫组的抗体效价均较其他实验组高。免疫组化检测发现3D蛋白定位于肝脏细胞的细胞质内，与预测的相符合。 综上，DHAV-H3D蛋白免疫雏鸭可产生一定程度免疫保护力。3D蛋白具有免疫增强作用，体现在细胞免疫和体液免疫两方面。