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目的分析DKK3基因启动子在HPV感染相关宫颈癌细胞系及宫颈组织中的甲基化状态，以及其对表达所产生影响。
方法选取宫颈癌细胞系(HT-3, C-33A, Siha, Caski, and HeLa)、宫颈癌组织186例、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)组织58例，正常宫颈组织40例，采用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)以及焦亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing, BGS)分别针对DKK3基因在细胞和组织样本中甲基化状态进行检测。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测细胞系及组织中DKK3基因的转录表达情况。
结果①MSP及BGS检测结果表明DKK3基因在HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa中呈高甲基化状态，而其他4种宫颈癌细胞系Siha,Caski,HT-3和C-33A中均呈低甲基化状态。②DKK3基因启动子的甲基化率在宫颈癌组织中(54/186, 31.7%)明显高于CIN组织[DKK3基因甲基化率在CIN1中为(1/16)6.3%;CIN2中为(2/14)14.3%；CIN3中为(6/28)21.4%]和正常宫颈组织(2/40, 5.0%)(P＜0.05)。③HPV阳性宫颈癌组织样本中DKK3基因启动子的甲基化率明显高于正常组(P＜0.05)。④HPV18阳性宫颈癌组织样本中DKK3基因甲基化率明显高于HPV16阳性组(P＜0.05)。⑤DKK3基因甲基化率在患者年龄、病理类型、淋巴结转移、FIGO分期、HPV感染、肿瘤分化程度中差异无统计学意义(P＞0.05)，而在肿瘤直径中的差异有统计学意义(P＜0.05)。⑥宫颈癌细胞系、CIN及宫颈癌组织样本中DKK3基因mRNA的转录水平均明显低于正常组织(P＜0.05)。⑦此外，在发生甲基化的宫颈癌组织中DKK3基因的转录表达水平低于未发生甲基化者(P＜0.05)。⑧同样，发生甲基化的CIN组织中DKK3基因的转录表达水平较未发生甲基化的CIN样本低(P＜0.05)。
结论DKK3基因异常的启动子甲基化存在于宫颈癌，HPV感染(特别是HPV18型)能够诱导其发生高甲基化，从而导致下调DKK3基因的转录表达。
方法选取宫颈癌细胞系(HT-3, C-33A, Siha, Caski, and HeLa)、宫颈癌组织186例、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)组织58例，正常宫颈组织40例，采用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)以及焦亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing, BGS)分别针对DKK3基因在细胞和组织样本中甲基化状态进行检测。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测细胞系及组织中DKK3基因的转录表达情况。
结果①MSP及BGS检测结果表明DKK3基因在HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa中呈高甲基化状态，而其他4种宫颈癌细胞系Siha,Caski,HT-3和C-33A中均呈低甲基化状态。②DKK3基因启动子的甲基化率在宫颈癌组织中(54/186, 31.7%)明显高于CIN组织[DKK3基因甲基化率在CIN1中为(1/16)6.3%;CIN2中为(2/14)14.3%；CIN3中为(6/28)21.4%]和正常宫颈组织(2/40, 5.0%)(P＜0.05)。③HPV阳性宫颈癌组织样本中DKK3基因启动子的甲基化率明显高于正常组(P＜0.05)。④HPV18阳性宫颈癌组织样本中DKK3基因甲基化率明显高于HPV16阳性组(P＜0.05)。⑤DKK3基因甲基化率在患者年龄、病理类型、淋巴结转移、FIGO分期、HPV感染、肿瘤分化程度中差异无统计学意义(P＞0.05)，而在肿瘤直径中的差异有统计学意义(P＜0.05)。⑥宫颈癌细胞系、CIN及宫颈癌组织样本中DKK3基因mRNA的转录水平均明显低于正常组织(P＜0.05)。⑦此外，在发生甲基化的宫颈癌组织中DKK3基因的转录表达水平低于未发生甲基化者(P＜0.05)。⑧同样，发生甲基化的CIN组织中DKK3基因的转录表达水平较未发生甲基化的CIN样本低(P＜0.05)。
结论DKK3基因异常的启动子甲基化存在于宫颈癌，HPV感染(特别是HPV18型)能够诱导其发生高甲基化，从而导致下调DKK3基因的转录表达。