【摘 要】
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PNA是Nielsen(尼尔森)工作组在1991年人工合成的一种DNA的类似物,它用中性的多肽骨架取代了DNA中带负电的糖环-磷酸根骨架,其骨架是由重复的N-2-(氨基乙基)甘氨酸为骨架单元
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PNA是Nielsen(尼尔森)工作组在1991年人工合成的一种DNA的类似物,它用中性的多肽骨架取代了DNA中带负电的糖环-磷酸根骨架,其骨架是由重复的N-2-(氨基乙基)甘氨酸为骨架单元通过酰甲基与碱基相连而成的,所以使得它的骨架是电中性的,而且不易被核酸酶和蛋白酶所降解。由于在PNA中缺少磷酸二酯键形成的带负电的骨架,降低了与互补DNA的静电排斥作用,使得与互补DNA的杂化有更大的亲和性和特异性,导致PNA-DNA双链比对应的DNA-DNA双链更加稳定。更重要的是,PNA-DNA双链的稳定性是独立于离子强度的,碱基错配严重影响PNA-DNA杂化体的稳定性,甚至单碱基错配能显著降低PNA-DNA之间的相互作用。以上面所提到的性质为基础,结合金属Ni2+和PNA-DNA的相互作用机制,本论文采用电化学阻抗谱的方法对单碱基错配进行了检测,具体如下: 1.在金电极上组装完全匹配以及八种存在单个碱基错配的PNA-DNA双链,和金属Ni2+作用2h,在与Ni2+作用前后,以[Fe(CN)6]3-/4-为氧化还原探针,在pH=8.8时,用电化学阻抗谱EIS测量,用等效电路进行拟合后分析,得出对于匹配的PNA-DNA双链和存在单个碱基错配的PNA-DNA双链,它们的△RCT值是不同的,以此来区分匹配和八种单碱基错配,并且做了检测限,检测目标DNA的检测限可以达到10fM(相当于在直径是1mm金电极上,可以检测到1000个目标DNA分子)。 2.在实际生物体系(人类血清溶液和红细胞裂解液)中检测单碱基错配。以T-C错配为例,通过在位杂化进行检测,用电化学阻抗谱进行分析,等效电路进行拟合后,效果很好,小受实际体系的影响,然后将其应用于检测与老年痴呆症相关的载脂蛋白apoE4的基因突变,最后我们测试了这种方法在实际体系中检测单碱基错配的灵敏度,根据拟合的结果可以看到:在实际体系中并不干扰这种检测方法的灵敏度,那么以T-C错配为例,在这两种实际体系中,检测限都达到了10fM,说明这种方法的检测是不受实际体系干扰的,而且灵敏度还很高。 3.为了提高灵敏度,以DNA作为探针来区分匹配和错配,通过实验数据显示,我们发现:以DNA作为探针灵敏度(△(△RCT)=910Ω·cm2)更好。为了对双链不同位置的错配进行区分,我们以DNA作为探针和目标:PNA杂化,分别形成完全匹配以及在双链中部、顶部和底部存在T-C错配的DNA-PNA双链,让它们分别和Ni2+作用2h,测量和N2+作用前后的阻抗,通过△RCT,这个重要的参数我们可以很好的将其区分。
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