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第一部分研究背景：由于成熟心肌细胞不能够自我复制，因此，在心肌梗死等心血管疾病时，受损后的心肌细胞不能再生，导致心肌细胞丢失，心脏功能下降。1994年，Soonpaa首次发现将小鼠胚胎干细胞移植到成年小鼠发生梗死的心肌中，能够存活并且能够限制疤痕发展及预防梗塞后心衰的发生，提示干细胞移植治疗可能是解决心肌损伤后的修复的重要手段。干细胞移植作为心肌再生的一个重要途径，日益成为研究热点。研究发现，可以用于心肌修复的细胞来源颇多，包括骨骼肌细胞、胚胎干细胞、胎儿心肌细胞、骨髓造血干细胞、骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)等。其中骨髓间质干细胞移植较容易从自体成年骨髓中获得，且易于体外扩增，自体移植可避免免疫排斥反应，也无伦理问题。因此，近几年国内外对移植骨髓间质干细胞治疗心脏疾病进行了动物和临床试验。然而，要进行骨髓间质干细胞的移植治疗，首要问题是对骨髓间质干细胞的本身特性，其分化的潜能，分化的特点有全面而深入地研究，这样才能更好地指导临床实践。因此，本部分着重研究了大鼠骨髓间质干细胞(ratMSCs，rMSCs)的基本特性和其向心肌细胞方向分化的潜能及分化条件，为临床进行骨髓间质干细胞的细胞移植提供基础理论依据和参考。
目的：明确MSCs在体外培养过程中的生长特性，探讨其向心肌细胞分化的潜能以及影响因素，探索最佳的体外诱导分化条件，为临床进行细胞移植治疗提供理论依据。方法：
4周龄(约100g)Sprague-Dawlay(SD)大鼠，经麻醉后，从股骨和胫骨骨髓中分离、提纯、扩增rMSCs。分别采用相差显微镜观察，细胞计数法和流式细胞仪观察细胞传代的第1(P1)、4(P4)、8(P8)和12代(P12)rMSCs的形态、生长特性和细胞周期。探索5-氮胞苷(5-azacytidine，5-aza)诱导骨髓间质干细胞向心肌细胞分化的能力。用5-aza刺激P1，P4，P8等不同传代数的rMSCs，观察细胞形态结构的变化，采用RT-PCR和免疫荧光等方法，检测诱导后心肌细胞特异性的转录因子、基因和蛋白的表达。
结果：1.P1、P8和P12rMSCs增殖方式相似，均呈指数增殖模式，倍增周期在32-38小时；而P4rMSCs呈静息状态，倍增周期约100小时。
2.5-aza能够刺激P4rMSCs向心肌样细胞分化。在诱导后的1，2，3，和4周进行心肌细胞特异性的转录因子和基因的检测，在P4MSCs诱导后一周，能够检测到心肌细胞特异性转录因子的表达，如Nkx2.5，GATA4；在诱导后2周可以检测到心肌特异性基因的表达，如α-肌球蛋白重链(α-myosinheavychain，α-MHC)，肌浆网钙泵2a(sarcoplasmicreticulumCa2+ATPaseisoform2a，SERCA2a)，α-sarcomericactin和troponinI。在诱导的第4周，通过免疫组化检测到心肌细胞特异性的蛋白α-sarcomericactin和troponinT阳性表达。而在P1和P8rMSCs中不能检测到。
3.经过有丝分裂抑制剂5-溴尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine，Brdu)处理P1和P8rMSCs，能抑制其增殖。再经5-aza诱导，观察到P1能成功地分化为心肌样细胞，而P8不能分化为心肌样的细胞。
4.检测P1、P4和P8rMSCs表达的三胚层标志基因，以及干细胞自我更新基因oct-4，我们观察到rMSCs在体外培养过程中，随着传代数地增加，自我更新基因oct-4表达逐渐降低，而三胚层标志基因的表达未观察到明显的差异。
结论：从SD大鼠来源的MSCs仅有有限的向心肌样细胞分化的潜能。在体外，5-aza等刺激药物可诱导MSCs向心肌样细胞的分化，但是难以得到具有跳动的功能性的心肌细胞，而且，传至第8代后，向心肌细胞方向分化的潜能便丧失。同时，其体外的分化潜能在低传代数时与其增殖能力呈反向关系。
第二部分研究背景：Bcl-2是最重要的凋亡相关蛋白家族之一。它分为三类，一类是是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2，Bcl-XL等；另一类是促凋亡蛋白，包括Bax等；第三类是BH3only亚家族。BNIP3全称为Bcl2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirusE1B19kDainteractingprotein3，BNIP3)，是新近发现的BH3only亚家族成员之一，也是低氧敏感的凋亡基因，且BNIP3在心脏疾病中的凋亡中扮演至关重要的作用。因此，近年来BNIP3在低氧诱导凋亡的研究中十分引人注目。低氧激活HIF1α，HIF1α又活化下游一系列基因，如促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)，BNIP3等。通过激活EPO等表达提高细胞的抗损伤能力，而通过激活BNIP3的表达，促进细胞凋亡。BNIP3表达后，如果蛋白转位至线粒体膜上，形成同源(homogenous)或异源(heterogenous)二聚体，组成通透性转换孔(permeabilitytransitionpore，PTP)，使线粒体内细胞色素C(cytochromeC)等小分子释放到胞浆中，从而激活了下游的半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶(caspases)家族，诱导细胞凋亡的发生。
在心肌缺氧损伤模型中，观察到BNIP3表达明显上调，深入研究BNIP3凋亡通路，有助于理解低氧诱导细胞凋亡的机制，也为人类解决缺氧类疾病提供有益的线索。然而，在心肌细胞等细胞中观察到BNIP3单独表达升高，并不能诱导细胞凋亡。而低氧以及低pH值情况下，BNIP3均可以诱导心肌细胞凋亡。这促使我们提出一个新的问题，低氧能促进BNIP3表达升高，并诱导细胞凋亡，应该还存在其它因素与BNIP3共同作用诱导凋亡。我们知道，低氧不仅可以通过诱导HIF1α表达活化下游的BNIP3表达升高，同时低氧能影响细胞能量代谢，降低细胞内ATP含量，因此我们提出假说：ATP可能参与了BNIP3凋亡通路。
目的：探讨BNIP3信号通路在低氧诱导凋亡中的调控机制，明确低氧下细胞ATP含量变化在BNIP3导致凋亡中的作用，以进一步阐明低氧损伤诱导BNIP3相关的细胞凋亡的机理，并为防治低氧损伤导致的凋亡提供理论依据。
方法：采用HEK293细胞系，建立BNIP3过表达的细胞系，比较观察化学性低氧对HEK293细胞系和BNIP3过表达细胞系引起细胞凋亡的影响。在此基础上，进一步分析了细胞代谢抑制和线粒体电化学脱偶联等不同条件下，BNIP3的转位和细胞凋亡情况，研究了ATP在BNIP3导致细胞凋亡中的重要作用。
结果：1、单独BNIP3基因过表达不能诱导HEK293细胞凋亡。BNIP3单独过表达也不会影响线粒体的膜电位和线粒体形态结构。
2、化学性低氧模拟剂可使BNIP3表达增强，并诱导HEK293细胞凋亡。
3、BNIP3过表达的细胞系对化学性低氧模拟剂诱导的细胞凋亡明显敏感于正常的HEK293细胞。
4、线粒体膜电位丢失不影响HEK293和BNIP3过表达的细胞凋亡。线粒体膜电位丢失也不影响BNIP3向线粒体转位。
5、细胞内ATP含量下降能明显促进BNIP3过表达细胞的凋亡。
6、细胞内ATP含量下降促进BNIP3蛋白向线粒体转位，促进BNIP3诱导细胞凋亡。
7、细胞内ATP水平下降到基础水平的10％-50％能引发BNIP3转位到线粒体膜和引发BNIP3过表达细胞凋亡。
结论：单独BNIP3基因表达增强并不能诱导细胞凋亡。化学性低氧模拟剂可使BNIP3表达增强，并诱导HEK293细胞凋亡，但是过表达BNIP3细胞对化学性低氧模拟剂诱导的细胞凋亡更为敏感。在化学性低氧诱导细胞凋亡的过程中，ATP是BNIP3导致细胞凋亡的关键性因素之一。单独ATP下降不诱导细胞凋亡，但ATP下降到一定程度能促进BNIP3向线粒体转位，从而诱导了BNIP3相关的凋亡。这可能是低氧诱导BNIP3表达导致细胞凋亡的重要机制之一。