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本论文主要内容就是利用产生唾液酸酶的溶黄嘌呤厄菌(Oerskovia xanthineolytica)通过细胞、游离酶、固定化酶三种方法生物转化多唾液酸神经节苷脂(GLS)产生单唾液酸神经节苷脂(GM1)。
通过单因素法和响应面分析法优化了O.xanthineolytica的产酶条件。优化后的培养基组成为:酵母粉24.5 g/L,蛋白胨8.0g/L,NaCl 11.6 g/L。培养条件:37℃,pH 8.0,200 rpm,接种量为5%,培养7 h后加入5%神经节营脂粗品,培养24 h。得到酶活为636 U/ml,比对照提高了4.89倍。在3.7 L发酵罐中转化时,唾液酸酶的最高活力为789U/ml,GM1的含量从10%提高到46%,转化率为75%(w/w)。粗酶液在透析条件下反应,GM1的含量从9.8%提高到40%,转化率为86%。
以Eupergit C为载体,经过优化后的唾液酸酶固定化条件为:100 mg蛋白质/g载体,20℃,以1.5 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)为缓冲体系,固定化36 h后得到的固定化酶活力为319 U/g。固定化酶对GLS的转化率为88%,GM1的含量为从9.9%提高到39%。
游离酶和固定化酶的的最适反应温度均为37℃;最适pH分别为5.5,6.0。游离酶在pH 7.5、30℃的条件下稳定性较好。固定化酶在pH 7.0、20℃时,固定化酶最稳定。固定化酶的Km值为1.45×10-3 mmol/L,Vmax值为909 μmol/min。游离酶Km值仅为固定化酶的28%。固定化酶催化时间比游离酶长。与微生物转化相比,游离酶和固定化酶转化得到了另一个重要的药物中间体——唾液酸。