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牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)是牙周组织的重要组成部分,可分化为成牙骨质细胞和成骨细胞,二者分别形成牙骨质和牙槽骨,对牙周组织的修复具有十分重要的功能[l]。鞣质具有显著的收敛、抗氧化、解毒、抑菌及保护黏膜等作用。随着人们对鞣质结构及化学成分的深入研究,鞣质在口腔临床医学中的应用也日益广泛。柿子中含有丰富的鞣质类物质,本研究使用经乙醇超声提取而出的柿鞣质提取液,通过体外细胞培养技术,采用MTT、考马斯亮蓝染色法、碱性磷酸酶法等实验技术,观察柿鞣质水提取液(persimmon tannin water extract)对PDLCs的细胞数量、细胞总蛋白含量及ALP活性的影响,探讨柿鞣质水提取液对人牙周组织修复再生功能的作用。目的:牙周病是口腔常见病和多发病,是一种发生在牙周支持组织上的、以细菌为主的感染性疾病,是成年人口腔中病理性失牙最主要的原因。很多学者对中药在牙周病的治疗和预防方面进行了大量的研究,使用天然药物防治口腔疾病越来越受到国内外学者的关注。牙周组织再生是在细胞合成和分泌蛋白的基础上进行的,细胞内蛋白含量水平高低可以反映细胞功能旺盛与否;ALP活性的高低可反映PDLCs向成骨方向转化的趋势。本实验旨在体外原代培养PDLCs的基础上,观察不同浓度的柿鞣质水提取液在不同时间点对PDLCs的细胞数量、细胞总蛋白含量及ALP活性的影响,明确其对人牙周膜成纤维细胞的增殖作用,为证实柿鞣质具有促进牙周健康提供实验依据。方法:1柿果实鞣质的提取:对全柿果实进行超声提取,并对柿鞣质粗提取液进行脱糖,超滤,得到分子量为10000的柿鞣质溶液,利用Folin-Denis法测定提取液中鞣质含量。取全柿鞣质水提取液,使用0.22μm滤菌器过滤除菌,4℃避光保存备用。2细胞培养:取正畸需要拔除的无龋、无牙周病的10~16岁青少年前磨牙,随即放置于含有双抗预冷的DMEM培养基中。在超净工作台内,无菌刀片刮取牙根中1/3的牙周膜组织,剪成l mm×l mm×l mm小块后,平铺于25 m L培养瓶中,从对侧加入含有20%血清、0.1%双抗的DMEM培养基2 m L。在CO2培养箱中,37℃、5%CO2饱和条件下培养4 h后,翻转培养瓶,继续培养。有细胞游出后,每隔3天换液。细胞长满瓶底壁后,以0.25%胰蛋白酶消化,传代。凡免疫组化角蛋白阴性、波形蛋白阳性的4~6代细胞用于实验。配制系列浓度的柿鞣质水提取液:柿鞣质水提取液浓度依次为:0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088 mg/m L、0.147mg/m L、0.440 mg/m L及0 mg/m L(对照组)。MTT法测定细胞数量变化:取第5代细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/m L的细胞浓度接种到96孔板,每孔100?L,培养24 h后,吸弃原有培养液,用PBS液轻轻洗3次,吸干,每孔加入条件培养液200?L,每个浓度组6个复孔。分别于培养24 h、48 h、72 h后,每孔加入MTT(0.5mg/m L)20??L,37℃、5%CO2饱和条件下培养4 h,吸弃培养液,每孔加入DMSO 150?L,振荡10 min,于酶标仪测定波长为490 nm处溶液的OD值。考马斯亮蓝染色法测定细胞总蛋白含量:取第5代细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/m L的细胞浓度接种到96孔板,每孔100?L,培养24 h后,吸弃原有培养液,每孔加入条件培养液200?L,每个浓度组6个复孔。分别于培养24 h、48 h、72 h后,每孔加入100?L 0.1%Triton X-100,室温下振荡30 min,观察己无完整细胞结构后,吸取20?L,转移到另一块96孔板,每孔加入考马斯亮蓝染液200?L,室温下振荡10 min,用酶标仪在590 nm波长处测定溶液的OD值。碱性磷酸酶法测细胞活性:取第5代细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/m L的细胞浓度接种到96孔板,每孔100?L,培养24 h后,吸弃原有培养液,每孔加入条件培养液200?L,每个浓度组6个复孔。分别于培养24 h、48 h、72 h后,每孔加入100??L 0.1%Triton X-100,室温下振荡30 min,观察己无完整细胞结构后,吸取50?L,转移到另一块96孔板,每孔加入ALP底物染液100?L,37℃恒温水浴10 min,每孔加0.2mol/L Na OH 50?L止反应。用酶标仪在410 nm波长处测定溶液的OD值。结果:1在24 h、48 h、72 h三个时间点,与对照组比较,不同浓度柿鞣质水提取液均能促进人PDLCs细胞数量增长,且呈浓度依赖性。各种浓度柿鞣质水提取液(0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088mg/m L、0.147 mg/m L及0.440 mg/m L),在24 h、48 h、72 h三个时间点均能促进人PDLCs细胞数量增长,且呈时间依赖性。2在24 h、48 h、72 h三个时间点,与对照组比较,不同浓度柿鞣质水提取液均能促进人PDLCs细胞总蛋白的合成,且呈浓度依赖性。各种浓度柿鞣质水提取液(0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088 mg/m L、0.147 mg/m L及0.440 mg/m L),在24 h、48 h、72 h三个时间点均能促进人PDLCs细胞总蛋白的合成,且呈时间依赖性。3在24 h、48 h、72 h三个时间点,与对照组比较,不同浓度柿鞣质水提取液均能促进人PDLCs细胞活性增强,且呈浓度依赖性。各种浓度柿鞣质水提取液(0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088mg/m L、0.147 mg/m L及0.440 mg/m L),在24 h、48 h、72 h三个时间点均能促进人PDLCs细胞活性增强,且呈时间依赖性。结论:柿鞣质水提取液对人牙周膜成纤维细胞数量、总蛋白质含量及细胞活性均具有时间依赖性和浓度依赖性。柿鞣质水提取液能促进细胞数量增长,促进蛋白质的合成,并使得细胞活性增强,表明柿鞣质水提取液具有促进人牙周膜成纤维细胞增殖的作用,从而为证实柿鞣质在人牙周组织修复中具有促进作用提供实验依据。