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1.研究背景 溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis，UC）是一种病因尚未明确的肠道慢性非特异性炎性疾病。目前，UC被公认为与自身免疫相关，因此改善免疫紊乱成为治疗UC的新方向[1]。IL-1β是溃疡性结肠炎发病中的关键因子[2-4]。IL-1β由固有淋巴细胞NLRP3（NACHT、LRR and PYD domains-containing protein3)炎性小体激活后诱导生成。NLRP3，NLRP3炎性小体与含有CARD凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱天冬蛋白酶1前体（pro-casepase1）共同组装成大分子多蛋白复合体[5-6]。NLRP3炎性小体一旦被激活，可使无活性的casepase1前体转化为有活性的casepase1，casepase1进一步将无活性的促炎因子IL-1β和IL-18的前体剪切加工为成熟的IL-1β和IL-18，同时caspase1还可以使细胞发生特殊的程序性死亡[7-9]，导致IL-1β、IL-18等细胞内容物释放，诱导其他免疫炎症细胞浸润[10-11]。有研究显示NLRP3基因敲除小鼠对口服2%DSS诱导的结肠炎的易感性明显降低[12]，使用NLRP3抑制剂Fclla-2能降低IL-1β的表达，缓解小鼠急性结肠炎症[13]。所以抑制NLRP3炎性小体活化，减少IL-1β生成，进而抑制IL-17生成细胞（ILC17、TH17）活化，减轻炎症反应，有望成为治疗UC的新途径。 本项目组长期研究UC，制定的五味苦参灌肠方（苦参、地榆、青黛、白芨、生甘草）在临床治疗UC中取得满意疗效，后采用PH依赖口服结肠定位释药系统（oral colon-specific drug delivery system，OCDDS），研制成五味苦参肠溶胶囊（原名为：复方苦参肠溶胶囊），实现了药物到达PH6.5左右的结肠部位定点释放，发挥局部治疗最大效力。目前已完成2项多中心随机对照临床试验[14-15]，提示该胶囊治疗活动期UC等效于柳氮磺吡啶片和不劣于美沙拉秦缓释颗粒，镜下组织学改变率高于西药组，副反应小，为五味苦参肠溶胶囊代替西药治疗UC提供循证医学证据，获得军队科技成果三等奖及国家新药证书（国药准字：Z20150002）。刘海燕、赵军等[16-17]也用本药物进行临床试验取得一致结果，证实五味苦参肠溶胶囊（曾用名：复方苦参结肠溶胶囊）能有效改善湿热型溃疡性结肠炎证候并能减少副反应、降低复发率。 2.目的 进一步研究五味苦参肠溶胶囊对溃疡性结肠炎体外模型的作用，通过研究五味苦参肠溶胶囊对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型释放炎性因子的影响，探讨五味苦参肠溶胶囊对溃疡性结肠炎的治疗作用，为五味苦参肠溶胶囊作用于溃疡性结肠炎提供理论和实验依据。 3.方法 体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7，使用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激细胞，模拟炎症环境。根据干预药物的不同，实验分为5组：空白对照组，模型组，高、中、低剂量五味苦参肠溶胶囊含药血清组。分组处理24h后，应用CCK-8法检测细胞生长情况；ELISA、RT-PCR法检测NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α及IL-17在蛋白和基因水平上的表达情况，探讨五味苦参肠溶胶囊对NLRP3炎性小体活化产生IL-1β的影响。 3.1.实验一：CCK-8法评价五味苦参肠溶胶囊含药血清对RAW264.7细胞的毒性作用 CCK-8法评价不同浓度五味苦参肠溶胶囊含药血清与正常血清相比对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的毒性作用的差异。 3.2.实验二：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测五味苦参肠溶胶囊含药血清对RAW264.7细胞炎性因子的表达的干预作用 ELISA法检测非毒浓度（10%）高、中、低剂量组含药血清对细胞炎性小体及炎症因子NLRP3、TNF-α、IL-17等表达水平的影响；非毒浓度高、中、低剂量组含药血清（10%）与LPS(20ng/mL)共同作用于RAW264.7细胞24小时后，ELISA法检测NLRP3、caspase1、TNF-α、IL-1β、IL-17的蛋白表达水平。 3.3.实验三：逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测相关炎症因子基因mRNA的表达 逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测非毒浓度（10%）高、中、低剂量组含药血清对细胞炎性小体及炎症因子caspase1、IL-1βmRNA的表达水平。 4.结果 4.1.五味苦参肠溶胶囊含药血清在10?20%浓度下与正常血清相比对RAW264.7细胞的毒性作用无明显差异 细胞毒性试验（CCK-8）结果显示，五味苦参肠溶胶囊含药血清在5%?20%浓度范围内，与正常血清对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，选择无明显干预作用的含药血清浓度范围（5%?20%）进行后续实验。本实验统一采用10%的含药血清干预检测相关指标。 4.2.五味苦参肠溶胶囊含药血清抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症因子的表达 ELISA及RT-PCR结果显示，用非毒浓度（10%）的高、中、低剂量组含药血清作用于RAW264.7细胞24小时，与正常血清对照组相比，五味苦参肠溶胶囊含药血清对NLRP3、caspase1、TNF-α、IL-1β、IL-17的产生基本没有影响。进一步用非毒浓度（10%）的高、中、低剂量组含药血清联合LPS(20ng/ml)共同作用于RAW264.7细胞24小时，发现五味苦参肠溶胶囊含药血清能有效抑制LPS诱导RAW264.7细胞NLRP3、caspase1、TNF-α、IL-1β、IL-17的表达。 5.结论 五味苦参肠溶胶囊含药血清能抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞的炎症反应，其作用机制可能与抑制NLRP3炎性小体激活及无活性的caspase1转化为有活性的caspase1，进而抑制caspase1诱导细胞程序性死亡释放IL-1β、IL-17等炎性因子有关。