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艾滋病的抗逆转录病毒疗法取得了成功，但仍不能彻底治愈，且患者需要终生服药。现存药物的毒副作用，HIV耐药毒株的出现及彻底清除体内潜伏病毒库是艾滋病治疗面临的主要问题，需要研究新型抗艾滋病病毒药物。对候选药物进行快速准确地抗HIV活性评价，是HIV药物研发的基础和关键环节;准确阐明药物的作用靶点和作用机制，是候选药物成药研究的重要组成部分。该研究基于表面等离子共振技术，建立了靶点导向的抗HIV药物综合筛选模型，对一百多个样本进行抗HIV活性筛选，发现三种不同作用靶点的候选药物。具体研究内容包括以下几个方面:
建立和优化了靶点导向的抗HIV药物综合筛选模型。基于表面等离子共振技术，优化了SPR-BIAcore多靶点(进入、逆转录、整合等)药物筛选模型;筛选药物采用单轮细胞感染实验、细胞融合抑制实验、MT4细胞感染实验和PBMC细胞感染实验进行了药效学验证，并对上述方法进行条件优化。此外优化HIV感染潜伏再激活J-Lat细胞模型，建立了靶向抑制HIV病毒复制和潜伏再激活的药物综合筛选模型，并筛选了112种天然产物、小分子化合物等。结果发现了13种与靶蛋白有高亲和力的样本，其中两个候选药物PT-1和HZ60在后续药学实验中均显示显著的抗HIV-1活性。中药了哥王醇提物在HIV感染潜伏再激活J-Lat细胞模型中对潜伏感染HIV-1有再激活作用。
进一步对PT-1、HZ60和了哥王三种候选药物的作用机制进行初步探讨。结果发现:
(1)采用CCK8细胞毒性检测、AnnxinV/PI凋亡检测、小鼠微核实验，结果显示PT-1细胞毒性较小，未检测到对小鼠骨髓的遗传毒性，显示出良好的生物安全性。运用分时点加药实验、N-PAGE凝胶和流式细胞检测等方法进行机制研究，结果表明PT-1作用于病毒的进入阶段，可与gp41的NHR多肽结合，干扰gp41六螺旋束的形成，还可干扰HIV包膜蛋白gp120分子与细胞CD4分子的结合，抑制病毒进入靶细胞。此外，PT-1对逆转录酶和整合酶的3’加工有一定的抑制作用，呈现多靶点的抗HIV-1病毒作用。
(2)中药虎杖60％的醇提取物在药物综合筛选模型中与整合酶有高亲和力，采用整合酶偶联柱靶向性富集虎杖60％醇提物中与整合酶有高亲和力活性成分(HZ60-IN)。病毒感染实验表明HZ60-IN对HIV NL4.3和1084i单轮感染实验的IC50分别为31.94±8.96μg/mL和38.07+11.25μg/mL，在PBMC细胞中，对NI4.3病毒的抑制率最高达到50％以上。HZ60-IN对整合酶的3’加工和链转移均有抑制作用，其中对3’加工的IC50为6.54±1.69μg/mL，对链转移的IC50为2.56±0.97μg/mL。对HZ60-IN进行质谱分析，结合虎杖化合物库分析，推测其可能是槲皮素、大黄素和/或芦荟大黄素，其中槲皮素有良好的抗HIV病毒的作用。
(3)中药了哥王醇提物在药物综合筛选模型中对HIV感染潜伏再激活J-Lat细胞的再激活率大于50％(20μg/mL)，低浓度了哥王醇提物与潜伏再激活剂丁酸钠有协同作用。采用NF-kB蛋白抑制剂BAY11-7082、PDTC及PKC蛋白抑制剂G?6983、G?6850可降低了哥王醇提物对J-Lat11.1细胞的再激活作用，而PKC蛋白抑制剂G?6976对了哥王醇提物的再激活作用没有影响，提示NF-kB、PKC蛋白通路与了哥王醇提物再激活作用有关，且不同的PKC蛋白亚型参与了再激活作用。利用活细胞成像实时监测了哥王醇提物和NF-kB、PKC蛋白的相互作用，发现了哥王醇提物可促进p65蛋白、PKCα、PKCδ蛋白由胞浆向细胞核聚集，PKC抑制剂G?6983可抑制了哥王醇提物对p65蛋白的核易位作用，而G?6850和G?6976对了哥王醇提物的核易位没影响，提示了哥王醇提物可能通过激活PKCδ和/或PKCζ等蛋白，进一步激活NF-kB发挥再激活作用，iTRAQ蛋白组学分析发现了哥王醇提物主要影响J-Lat11.1细胞的代谢途径和信号转导相关蛋白，可升高转录激活因子STAT5B的水平。SIV mac251病毒感染恒河猴实验发现，皮下注射了哥王醇提物可瞬时增高恒河猴体内的SIV病毒载量，了哥王和丁酸钠合用组对恒河猴体内SⅣ病毒激活作用更持久，达到15天。
综上所述，该研究建立和优化了靶点导向的高通量抗HIV药物综合筛选模型，从百余种样品中发现了3种新型的抗HIV药物，并对3种候选药物抗病毒活性进行系统评价，初步探讨了其作用机制，为寻找新型的抗艾滋病药物奠定了研究基础。
建立和优化了靶点导向的抗HIV药物综合筛选模型。基于表面等离子共振技术，优化了SPR-BIAcore多靶点(进入、逆转录、整合等)药物筛选模型;筛选药物采用单轮细胞感染实验、细胞融合抑制实验、MT4细胞感染实验和PBMC细胞感染实验进行了药效学验证，并对上述方法进行条件优化。此外优化HIV感染潜伏再激活J-Lat细胞模型，建立了靶向抑制HIV病毒复制和潜伏再激活的药物综合筛选模型，并筛选了112种天然产物、小分子化合物等。结果发现了13种与靶蛋白有高亲和力的样本，其中两个候选药物PT-1和HZ60在后续药学实验中均显示显著的抗HIV-1活性。中药了哥王醇提物在HIV感染潜伏再激活J-Lat细胞模型中对潜伏感染HIV-1有再激活作用。
进一步对PT-1、HZ60和了哥王三种候选药物的作用机制进行初步探讨。结果发现:
(1)采用CCK8细胞毒性检测、AnnxinV/PI凋亡检测、小鼠微核实验，结果显示PT-1细胞毒性较小，未检测到对小鼠骨髓的遗传毒性，显示出良好的生物安全性。运用分时点加药实验、N-PAGE凝胶和流式细胞检测等方法进行机制研究，结果表明PT-1作用于病毒的进入阶段，可与gp41的NHR多肽结合，干扰gp41六螺旋束的形成，还可干扰HIV包膜蛋白gp120分子与细胞CD4分子的结合，抑制病毒进入靶细胞。此外，PT-1对逆转录酶和整合酶的3’加工有一定的抑制作用，呈现多靶点的抗HIV-1病毒作用。
(2)中药虎杖60％的醇提取物在药物综合筛选模型中与整合酶有高亲和力，采用整合酶偶联柱靶向性富集虎杖60％醇提物中与整合酶有高亲和力活性成分(HZ60-IN)。病毒感染实验表明HZ60-IN对HIV NL4.3和1084i单轮感染实验的IC50分别为31.94±8.96μg/mL和38.07+11.25μg/mL，在PBMC细胞中，对NI4.3病毒的抑制率最高达到50％以上。HZ60-IN对整合酶的3’加工和链转移均有抑制作用，其中对3’加工的IC50为6.54±1.69μg/mL，对链转移的IC50为2.56±0.97μg/mL。对HZ60-IN进行质谱分析，结合虎杖化合物库分析，推测其可能是槲皮素、大黄素和/或芦荟大黄素，其中槲皮素有良好的抗HIV病毒的作用。
(3)中药了哥王醇提物在药物综合筛选模型中对HIV感染潜伏再激活J-Lat细胞的再激活率大于50％(20μg/mL)，低浓度了哥王醇提物与潜伏再激活剂丁酸钠有协同作用。采用NF-kB蛋白抑制剂BAY11-7082、PDTC及PKC蛋白抑制剂G?6983、G?6850可降低了哥王醇提物对J-Lat11.1细胞的再激活作用，而PKC蛋白抑制剂G?6976对了哥王醇提物的再激活作用没有影响，提示NF-kB、PKC蛋白通路与了哥王醇提物再激活作用有关，且不同的PKC蛋白亚型参与了再激活作用。利用活细胞成像实时监测了哥王醇提物和NF-kB、PKC蛋白的相互作用，发现了哥王醇提物可促进p65蛋白、PKCα、PKCδ蛋白由胞浆向细胞核聚集，PKC抑制剂G?6983可抑制了哥王醇提物对p65蛋白的核易位作用，而G?6850和G?6976对了哥王醇提物的核易位没影响，提示了哥王醇提物可能通过激活PKCδ和/或PKCζ等蛋白，进一步激活NF-kB发挥再激活作用，iTRAQ蛋白组学分析发现了哥王醇提物主要影响J-Lat11.1细胞的代谢途径和信号转导相关蛋白，可升高转录激活因子STAT5B的水平。SIV mac251病毒感染恒河猴实验发现，皮下注射了哥王醇提物可瞬时增高恒河猴体内的SIV病毒载量，了哥王和丁酸钠合用组对恒河猴体内SⅣ病毒激活作用更持久，达到15天。
综上所述，该研究建立和优化了靶点导向的高通量抗HIV药物综合筛选模型，从百余种样品中发现了3种新型的抗HIV药物，并对3种候选药物抗病毒活性进行系统评价，初步探讨了其作用机制，为寻找新型的抗艾滋病药物奠定了研究基础。