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鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是一种由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus, DHV)感染导致的急性和高度致死性传染病,可引起21日龄以下的雏鸭发生急性肝炎,能引起腹泻,病死率高达100%,是严重危害养鸭业的疾病之一。DHV主要包括3个血清型,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。VP3蛋白位于衣壳表面,是DHV重要的结构蛋白之一。DHV-Ⅰ和人肠道病毒(Human parechovirus, HPeV)同属于小RNA病毒科。HPeV VP3蛋白的N-末端约20个氨基酸的区域具有很强的免疫原性,有文献报道DHV-1VP3蛋白在该区域有较高的表面可及性、亲水性值和抗原指数,同样具有较强的免疫原性。本研究运用截短表达策略,对N-端(5’端)基因进行截短,对VP3剩余片段进行了表达,为研发鸭病毒性肝炎疫苗试剂盒奠定了基础。本研究通过对VP3基因N-端(5’端)基因进行截短表达,并建立了间接ELISA方法来检测DHV-Ⅰ抗体,具体如下：(1)根据Gene Bank所登录的DHV-Ⅰ SH株VP3基因序列,设计了一对特异性引物。将扩增的VP3截短基因克隆至pETⅠ30α (+),构建重组载体pET-VP648。将重组载体转化至大肠杆菌表达菌株DE3中,使用IPTG诱导表达,获得融合蛋白Pro-VP648。经SDS-PAGE电泳分析,融合蛋白表达了一个相对分子量约为24KDa的蛋白,并以包涵体的形式存在。(2)大量诱导表达重组蛋白,在SDS-PAGE电泳结束后,用KC1染色法将目的条带切胶回收,加入少量PBS研磨匀浆化,以皮下5点注射法注射每只成年短毛雌兔0.5mg进行免疫,7d免疫一次,4次免疫后第7d心脏采血,采用常规方法制备血清并用Western blot检测多克隆抗体,结果显示多克隆抗体和病毒尿囊液特异性结合。(3)将纯化后的可溶性蛋白Pro-VP648作为抗原包被酶标板,建立检测DHV-1抗体的间接ELISA方法。采用棋盘方阵法确定ELISA实验中各级试剂的最佳工作浓度,并对一抗孵育时间、二抗反应时间和底物显色时间等条件进行优化。采用上述的最优实验条件检测30份健康鸭的血清,计算出阴性血清的平均值和方差,从而得出阴阳性血清的临界值及判定标准。棋盘方阵法确定的最佳抗原包被量为20ug/mL,最佳血清稀释浓度为1：80,二抗最佳稀释浓度为1：2000,一抗最佳孵育时间为1.5h,二抗最佳孵育时间为1h,最佳底物显色时间为10min,阴阳性临界值为0.255。应用建立的间接ELISA方法对江苏省泰州市示范园收集的80份疑似鸭肝炎血清进行检测,80份血清的阳性检出率为82.5%(66/80)。实验结果表明,VP35’端截短基因在大肠杆菌中得到了正确的表达,利用纯化后的融合蛋白所建立的间接ELISA方法对江苏泰州地区收集的鸭血清样品进行DHV-I抗体检测,证明表达的重组蛋白可以检测抗体；同时用Western blot检测重组蛋白免疫的家兔血清,用阴性血清作对照,又证明了多抗与抗原发生特异性的反应。本研究为鸭肝炎病毒的结构蛋白功能的研究以及基因工程苗的研发奠定了基础。