论文部分内容阅读
神经肌肉接头(Neuromuscular junction, NMJ)是运动神经和骨骼肌之间的突触连接。运动神经轴突末梢释放神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)，结合于突触后膜上的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)，引发突触后膜的终板电位，继而产生动作电位，使得肌肉兴奋收缩。神经系统通过NMJ支配和控制躯体的运动。NMJ的功能缺损会导致各类神经疾病，危害身体健康甚至危及生命。NMJ在结构和功能上与中枢神经系统的神经突触相似，且相对易于操作观察，是研究突触形成发育机制的经典模型，可为理解中枢神经系统突触形成、发育、成熟提供借鉴。目前研究已经发现调控NMJ形成发育的关键信号，但对于NMJ成熟的分子机制仍不完全清楚。突触消除(synapse elimination)和乙酰胆碱受体解聚(AChR clusters dispersion)是NMJ成熟的关键步骤。近年来的研究发现，补体及相关蛋白在中枢神经系统突触消除的过程中发挥了重要的作用。与补体蛋白在免疫系统中的作用方式相似，表达于发育的中枢神经系统中的补体蛋白如C1q可以标注需要消除的突触，小胶质细胞利用补体受体识别补体蛋白后，将被标注的突触清除。星形胶质细胞可以分泌促进补体蛋白表达的信号。C1q家族成员类C1q蛋白(C1q like，C1ql)也参与了突触发育成熟的调节。但补体蛋白在NMJ成熟过程中的作用和机制尚不清楚。
为了明确补体蛋白在NMJ成熟过程中的作用，我们首先采用RT-PCR的方法检测C1ql1-4及受体BAI1-3(brain-specific angiogenesis inhibitor1-3)在小鼠不同发育时期的神经肌肉组织中以及体外培养的施旺细胞和肌细胞系中的表达。我们发现，C1ql1-4在脊髓和施旺细胞中均有表达，BAI1-3在骨骼肌和体外培养的肌细胞系中均有表达。为了探索C1ql蛋白在乙酰胆碱受体解聚中的作用，我们以agrin在肌细胞中诱导的乙酰胆碱受体聚集为研究模型，发现C1ql不能诱导乙酰胆碱受体聚集，但在agrin去除后促进乙酰胆碱受体解聚，其中C1ql3的解聚效应具有剂量依赖性。为了确定C1ql蛋白的受体BAI是否参与乙酰胆碱受体解聚，我们利用CRISPR-Cas9系统分别构建了BAI1-3基因突变的肌细胞系，发现BAI3突变的肌细胞不能分化成肌管，而BAI1或BAI2突变的肌细胞中agrin诱导的乙酰胆碱受体聚集不受影响，并且BAI1突变能抑制C1ql3促乙酰胆碱受体解聚的作用。免疫共沉淀实验发现，BAI1能够与肌细胞内下游蛋白ELMO1(Engulfment and cell motility 1)蛋白结合。采用多肽阻断BAI1与ELMO1的相互作用能够抑制C1ql3促乙酰胆碱受体解聚作用，而在BAI1突变的肌管中过表达ELMO1能够促进乙酰胆碱受体解聚。在小鼠实验中，我们分别过表达C1ql3或缺失胞内段的BAI1以增强或抑制C1ql3/BAI1信号，并采用免疫荧光和共聚焦显微镜观察突触成熟期NMJ形态的改变。我们发现在小鼠骨骼肌中过表达C1ql3可促进突触消除，而抑制C1ql3/BAI1信号可延迟NMJ的成熟。综上所述，我们的结果表明C1ql3/BAI1信号在NMJ突触成熟具有重要作用。
为了明确补体蛋白在NMJ成熟过程中的作用，我们首先采用RT-PCR的方法检测C1ql1-4及受体BAI1-3(brain-specific angiogenesis inhibitor1-3)在小鼠不同发育时期的神经肌肉组织中以及体外培养的施旺细胞和肌细胞系中的表达。我们发现，C1ql1-4在脊髓和施旺细胞中均有表达，BAI1-3在骨骼肌和体外培养的肌细胞系中均有表达。为了探索C1ql蛋白在乙酰胆碱受体解聚中的作用，我们以agrin在肌细胞中诱导的乙酰胆碱受体聚集为研究模型，发现C1ql不能诱导乙酰胆碱受体聚集，但在agrin去除后促进乙酰胆碱受体解聚，其中C1ql3的解聚效应具有剂量依赖性。为了确定C1ql蛋白的受体BAI是否参与乙酰胆碱受体解聚，我们利用CRISPR-Cas9系统分别构建了BAI1-3基因突变的肌细胞系，发现BAI3突变的肌细胞不能分化成肌管，而BAI1或BAI2突变的肌细胞中agrin诱导的乙酰胆碱受体聚集不受影响，并且BAI1突变能抑制C1ql3促乙酰胆碱受体解聚的作用。免疫共沉淀实验发现，BAI1能够与肌细胞内下游蛋白ELMO1(Engulfment and cell motility 1)蛋白结合。采用多肽阻断BAI1与ELMO1的相互作用能够抑制C1ql3促乙酰胆碱受体解聚作用，而在BAI1突变的肌管中过表达ELMO1能够促进乙酰胆碱受体解聚。在小鼠实验中，我们分别过表达C1ql3或缺失胞内段的BAI1以增强或抑制C1ql3/BAI1信号，并采用免疫荧光和共聚焦显微镜观察突触成熟期NMJ形态的改变。我们发现在小鼠骨骼肌中过表达C1ql3可促进突触消除，而抑制C1ql3/BAI1信号可延迟NMJ的成熟。综上所述，我们的结果表明C1ql3/BAI1信号在NMJ突触成熟具有重要作用。