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目的：恶性胸腔积液常见于肿瘤晚期，以肺癌、乳腺癌和胃癌居多，是肿瘤晚期常见的一种并发症，常伴随胸膜压迫、呼吸困难、生活质量下降和生存期短等。恶性胸腔积液治疗方式包括置管引流、促进胸膜粘连和化疗药物灌注等，但总体有效率并不高，且毒副作用大，新的恶性胸腔积液的治疗方式有待开发。近年来肿瘤生物治疗取得较大的进展，免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗等方法相继进入临床应用，标志着免疫治疗的时代的来临。然而，天然免疫在肿瘤治疗中的研究相对落后，中性粒细胞是人体中数量最多的一类白细胞群体，其在抵抗细菌感染过程中发挥重要作用，中性粒细胞是否能在抗肿瘤过程中发挥作用仍不十分清楚。前期研究表明载药微颗粒对肿瘤展现出良好的治疗效果，并有效的杀伤肿瘤再生细胞。临床研究发现，胸腔积液患者经载药微颗粒治疗后，大量中性粒细胞趋化至胸腔，本论文研究目的为探究中性粒细胞在载药微颗粒治疗恶性胸腔积液中的作用。
方法：(1)临床研究：该研究选取非小细胞肺癌初诊伴随恶性胸腔积液患者，治疗方式为第一天培美曲塞(PEM, 500mg/m2)联合顺铂(DDP, 75 mg/m2)全身化疗，第5，7，9，11，13，15天胸腔灌注载药微颗粒(MTX-MPs,5×107个/50ml，含甲氨蝶呤25μg)或生理盐水(50ml)；(2)分别抽取第5天和第7天的胸腔积液，流式细胞术分析胸腔积液中的细胞变化情况；(3)分别构建BALB/c小鼠腹水模型和胸水模型，3天后注射载药微颗粒，观察小鼠生存期；(4)C57BL/6小鼠胸腔注射1×105Lewis或BALB/c小鼠腹腔注射1×105H22细胞，24小时后分别胸腔或腹腔注射PKH26标记的载药微颗粒，流式细胞术检测肿瘤细胞、巨噬细胞和中性粒细胞对载药微颗粒的摄取；(5)分离巨噬细胞、中性粒细胞和肿瘤细胞，分别经载药微颗粒处理后，transwell检测上清对中性粒细胞的趋化；(6)临床研究中，载药微颗粒治疗后不同时间点抽取胸腔积液，流式细胞术检测胸腔积液中中性粒细胞的变化；(7)分离胸腔积液中的巨噬细胞与载药微颗粒孵育2小时，通过PCR检测趋化因子CXCL1和CXCL2的mRNA水平变化、westernblot检测蛋白水平变化；(8)分别抽取第5天和第7天的胸腔积液，流式细胞术分析中性粒细胞表型的变化；PCR分析NOX2、arginase-1、MPO和iNOS的变化；(9)胸腔积液中的肿瘤细胞和A549细胞，分别与载药微颗粒治疗组第5天、第7天的中性粒细胞共孵育16小时，流式细胞术分析肿瘤细胞和A549细胞的凋亡并分析活性氧(ROS)抑制剂NAC/DPI对中性粒细胞杀伤肿瘤细胞的影响；(10)BALB/c小鼠腹腔注射1×105H22，分析载药微颗粒治疗18小时后腹腔中性粒细胞溶酶体的变化；(11 )分离载药微颗粒治疗前后胸腔积液中的中性粒细胞，扫描电镜分析释放中性粒细胞体外陷阱(NETs)的情况并分析NETs抑制剂对中性粒细胞杀伤A549细胞的影响；(12)分别分离对照组和载药微颗粒组第5天和7天中性粒细胞，与内皮细胞共培养2小时，检测上述中性粒细胞对内皮细胞通透性影响；(13)BALB/c小鼠腹腔注射1×105H22建立小鼠腹水模型，3天后腹腔注射载药微颗粒，连续注射3天，然后尾静脉注射1%的伊文思蓝(5 mg/kg)，1小时后处死小鼠，分光光度法检测腹腔伊文思蓝的含量；(14)小鼠胸腔注射1×105Lewis，10天后胸腔注射载药微颗粒，18小时后尾静脉注射Sytox染料，2小时后取胸膜血管做免疫荧光染色；(15)建立小鼠胸水模型，胸腔注射载药微颗粒或结合NETs抑制剂，连续注射5天，分析小鼠生存期。
结果：(1)胸腔积液患者经载药微颗粒治疗后胸腔中CD45+免疫细胞增加，CD45-肿瘤细胞减少；(2)中性粒细胞的比例和数量显著增加，而MDSC、NK细胞和巨噬细胞无明显变化；(3)载药微颗粒治疗后小鼠生存期明显延长，清除中性粒细胞后小鼠生存期缩短。(4)在Lewis肺癌胸水模型和H22腹水模型中，巨噬细胞高效摄取载药微颗粒；(5)在体外，巨噬细胞与载药微颗粒孵育2小时的上清对中性粒细胞具有趋化作用；(6)恶性胸腔积液患者经载药微颗粒治疗2小时后，胸腔积液中中性粒细胞开始增加；(7)胸腔积液中巨噬细胞与载药微颗粒孵育2小时后，巨噬细胞CXCL1和CXCL2的mRNA水平和蛋白水平均增加；(8)载药微颗粒治疗后胸腔中的中性粒细胞FSC变小，CD11b、CD54和CD66b表达上调，CD15表达下调；PCR分析发现NOX2、MPO和iNOS表达上调，arginase-1表达下调；(9)载药微颗粒组第7天的中性粒细胞对胸腔积液中肿瘤细胞和A549细胞的杀伤显著增加；NAC/DPI降低载药微颗粒处理的中性粒细胞内总ROS水平，并降低中性粒细胞对肿瘤细胞杀伤；(10)载药微颗粒治疗后小鼠腹腔中性粒细胞溶酶体增加；(11)扫描电镜发现载药微颗粒治疗后中性粒细胞释放大量的NETs；NETs抑制剂降低中性粒细胞对肿瘤细胞杀伤；(12)对照组分离的中性粒细胞使FITC-dextran通过内皮细胞的量增加，而载药微颗粒治疗后分离的中性粒细胞使其通过量减少；(13)小鼠腹水模型中，载药微颗粒治疗后小鼠血管通透性降低，伊文思蓝渗出减少；(14)载药微颗粒胸腔注射治疗后，胸膜血管做做免疫荧光染色发现NETs围绕血管周围；(15)NETs抑制剂减弱载药微颗粒对MPE的治疗作用，小鼠生存期变短。
结论：载药微颗粒治疗恶性胸腔积液后，大量中性粒细胞趋化至胸腔，趋化的数量与胸腔积液的消退呈正相关。在动物模型中进一步证实中性粒细胞在载药微颗粒治疗过程中发挥重要作用。机理研究发现，载药微颗粒使巨噬细胞释放中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL2，使中性粒细胞趋化至胸腔。该趋化过程赋予中性粒细胞抗肿瘤特性，这些中性粒细胞通过释放ROS和NETs杀伤肿瘤，同时释放的NETs覆盖血管内皮细胞外侧，减少组织液从血管渗出，抑制胸腔积液的产生，这些研究揭示了肿瘤细胞来源的微颗粒作为载体用于治疗恶性胸腔积液的潜力。
方法：(1)临床研究：该研究选取非小细胞肺癌初诊伴随恶性胸腔积液患者，治疗方式为第一天培美曲塞(PEM, 500mg/m2)联合顺铂(DDP, 75 mg/m2)全身化疗，第5，7，9，11，13，15天胸腔灌注载药微颗粒(MTX-MPs,5×107个/50ml，含甲氨蝶呤25μg)或生理盐水(50ml)；(2)分别抽取第5天和第7天的胸腔积液，流式细胞术分析胸腔积液中的细胞变化情况；(3)分别构建BALB/c小鼠腹水模型和胸水模型，3天后注射载药微颗粒，观察小鼠生存期；(4)C57BL/6小鼠胸腔注射1×105Lewis或BALB/c小鼠腹腔注射1×105H22细胞，24小时后分别胸腔或腹腔注射PKH26标记的载药微颗粒，流式细胞术检测肿瘤细胞、巨噬细胞和中性粒细胞对载药微颗粒的摄取；(5)分离巨噬细胞、中性粒细胞和肿瘤细胞，分别经载药微颗粒处理后，transwell检测上清对中性粒细胞的趋化；(6)临床研究中，载药微颗粒治疗后不同时间点抽取胸腔积液，流式细胞术检测胸腔积液中中性粒细胞的变化；(7)分离胸腔积液中的巨噬细胞与载药微颗粒孵育2小时，通过PCR检测趋化因子CXCL1和CXCL2的mRNA水平变化、westernblot检测蛋白水平变化；(8)分别抽取第5天和第7天的胸腔积液，流式细胞术分析中性粒细胞表型的变化；PCR分析NOX2、arginase-1、MPO和iNOS的变化；(9)胸腔积液中的肿瘤细胞和A549细胞，分别与载药微颗粒治疗组第5天、第7天的中性粒细胞共孵育16小时，流式细胞术分析肿瘤细胞和A549细胞的凋亡并分析活性氧(ROS)抑制剂NAC/DPI对中性粒细胞杀伤肿瘤细胞的影响；(10)BALB/c小鼠腹腔注射1×105H22，分析载药微颗粒治疗18小时后腹腔中性粒细胞溶酶体的变化；(11 )分离载药微颗粒治疗前后胸腔积液中的中性粒细胞，扫描电镜分析释放中性粒细胞体外陷阱(NETs)的情况并分析NETs抑制剂对中性粒细胞杀伤A549细胞的影响；(12)分别分离对照组和载药微颗粒组第5天和7天中性粒细胞，与内皮细胞共培养2小时，检测上述中性粒细胞对内皮细胞通透性影响；(13)BALB/c小鼠腹腔注射1×105H22建立小鼠腹水模型，3天后腹腔注射载药微颗粒，连续注射3天，然后尾静脉注射1%的伊文思蓝(5 mg/kg)，1小时后处死小鼠，分光光度法检测腹腔伊文思蓝的含量；(14)小鼠胸腔注射1×105Lewis，10天后胸腔注射载药微颗粒，18小时后尾静脉注射Sytox染料，2小时后取胸膜血管做免疫荧光染色；(15)建立小鼠胸水模型，胸腔注射载药微颗粒或结合NETs抑制剂，连续注射5天，分析小鼠生存期。
结果：(1)胸腔积液患者经载药微颗粒治疗后胸腔中CD45+免疫细胞增加，CD45-肿瘤细胞减少；(2)中性粒细胞的比例和数量显著增加，而MDSC、NK细胞和巨噬细胞无明显变化；(3)载药微颗粒治疗后小鼠生存期明显延长，清除中性粒细胞后小鼠生存期缩短。(4)在Lewis肺癌胸水模型和H22腹水模型中，巨噬细胞高效摄取载药微颗粒；(5)在体外，巨噬细胞与载药微颗粒孵育2小时的上清对中性粒细胞具有趋化作用；(6)恶性胸腔积液患者经载药微颗粒治疗2小时后，胸腔积液中中性粒细胞开始增加；(7)胸腔积液中巨噬细胞与载药微颗粒孵育2小时后，巨噬细胞CXCL1和CXCL2的mRNA水平和蛋白水平均增加；(8)载药微颗粒治疗后胸腔中的中性粒细胞FSC变小，CD11b、CD54和CD66b表达上调，CD15表达下调；PCR分析发现NOX2、MPO和iNOS表达上调，arginase-1表达下调；(9)载药微颗粒组第7天的中性粒细胞对胸腔积液中肿瘤细胞和A549细胞的杀伤显著增加；NAC/DPI降低载药微颗粒处理的中性粒细胞内总ROS水平，并降低中性粒细胞对肿瘤细胞杀伤；(10)载药微颗粒治疗后小鼠腹腔中性粒细胞溶酶体增加；(11)扫描电镜发现载药微颗粒治疗后中性粒细胞释放大量的NETs；NETs抑制剂降低中性粒细胞对肿瘤细胞杀伤；(12)对照组分离的中性粒细胞使FITC-dextran通过内皮细胞的量增加，而载药微颗粒治疗后分离的中性粒细胞使其通过量减少；(13)小鼠腹水模型中，载药微颗粒治疗后小鼠血管通透性降低，伊文思蓝渗出减少；(14)载药微颗粒胸腔注射治疗后，胸膜血管做做免疫荧光染色发现NETs围绕血管周围；(15)NETs抑制剂减弱载药微颗粒对MPE的治疗作用，小鼠生存期变短。
结论：载药微颗粒治疗恶性胸腔积液后，大量中性粒细胞趋化至胸腔，趋化的数量与胸腔积液的消退呈正相关。在动物模型中进一步证实中性粒细胞在载药微颗粒治疗过程中发挥重要作用。机理研究发现，载药微颗粒使巨噬细胞释放中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL2，使中性粒细胞趋化至胸腔。该趋化过程赋予中性粒细胞抗肿瘤特性，这些中性粒细胞通过释放ROS和NETs杀伤肿瘤，同时释放的NETs覆盖血管内皮细胞外侧，减少组织液从血管渗出，抑制胸腔积液的产生，这些研究揭示了肿瘤细胞来源的微颗粒作为载体用于治疗恶性胸腔积液的潜力。