【摘 要】
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目的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一个与人类慢性肝炎、肝硬化及肝癌的发生有密切关系的全球公共卫生问题。目前,全世界约有2.4亿人感染HBV,每年有50万至120万人死于慢性肝炎、肝硬化及肝癌。由于抗HBV蛋白与HBV的感染患者的治疗紧密相关,对抗HBV蛋白的研究成为热点。本课题筛选出新的潜在抑制HBV的蛋白EPN3,随后在Huh7、Hep G2细胞系及尾静脉注射的
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目的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是一个与人类慢性肝炎、肝硬化及肝癌的发生有密切关系的全球公共卫生问题。目前,全世界约有2.4亿人感染HBV,每年有50万至120万人死于慢性肝炎、肝硬化及肝癌。由于抗HBV蛋白与HBV的感染患者的治疗紧密相关,对抗HBV蛋白的研究成为热点。本课题筛选出新的潜在抑制HBV的蛋白EPN3,随后在Huh7、Hep G2细胞系及尾静脉注射的小鼠模型中,探讨EPN3对HBV复制的影响及其机制。方法1.通过对HBV高表达和不表达的Huh7细胞进行m RNA测序,筛选出差异蛋白,并通过si RNA进一步验证,从而筛选出对HBV有潜在抑制作用的EPN3蛋白。2.将HBV质粒（p PB）和si EPN3转染Huh7细胞,三天后收细胞及上清。用RT-q PCR方法检测HBV、EPN3 RNA表达水平;用q PCR方法检测细胞质中HBV DNA及分泌在细胞上清中的HBV DNA表达水平;用Western Blot方法检测EPN3蛋白的表达水平。3.将p PB和3FLAG-EPN3质粒转染Huh7或Hep G2细胞,三天后收细胞及上清。用Western Blot方法检测EPN3蛋白的表达水平;用RT-q PCR方法检测HBV RNA表达水平,q PCR方法检测细胞质中HBV DNA及细胞上清中分泌的HBV DNA表达水平;用ELISA方法检测HBs Ag的表达水平。4.将C57BL/6小鼠随机分为空载质粒注射组和质粒注射组,然后将p PB、3FLAG-EPN3或3FLAG质粒通过尾静脉注射入相应组别的小鼠中,24小时后,摘眼球采血,解剖后取肝脏。用ELISA方法检测血清中HBs Ag的表达水平;采用物理方法将肝组织破碎后,用RT-q PCR方法检测肝组织中HBV RNA表达水平;用q PCR方法检测肝组织中HBV DNA的表达水平;用Western Blot方法检测小鼠肝脏中EPN3蛋白的表达水平。5.将3FLAG-EPN3和p PB质粒转染进Huh7细胞中,转染后54小时后加Act D,三天后收细胞,用RT-q PCR方法检测HBV RNA表达水平。随后,将p CMV1.2x HBV/NL及其突变质粒分别与pc DNA-CP、3FLAG-EPN3、AID质粒转染进Huh7细胞中,三天后检测Nano Luc荧光素酶信号。6.将p53和p PB质粒转染Huh7细胞,三天后收细胞及其上清。用Western Blot方法检测p53和EPN3蛋白的表达水平;用RT-q PCR方法检测EPN3和HBV RNA的表达水平;用ELISA方法检测HBs Ag的表达水平。随后,将p53、p PB质粒、si EPN3转染Huh7细胞,三天后收细胞。用Western Blot方法检测p53和EPN3蛋白的表达水平;用RT-q PCR方法检测HBV RNA的表达水平。7.将p PB质粒转染Huh7细胞,8小时后换液并加入IFN-α,三天后收细胞。用Western Blot方法检测EPN3蛋白表达水平;用RT-q PCR方法检测p53、EPN3、HBV RNA表达水平。随后,将p PB质粒及si EPN3转染Huh7细胞,8小时后加IFN-α,三天后收细胞。用Western Blot方法检测EPN3蛋白的表达水平;用RT-q PCR方法检测HBV RNA的表达水平。结果1.m RNA测序后,与不表达HBV组相比,HBV高表达组有13个上调基因和29个下调基因。通过si RNA实验进一步证实,当沉默EPN3后,HBV RNA的表达水平上调。2.在细胞和尾静脉注射小鼠模型中过表达EPN3质粒,HBV表达水平下调。3.加入Act D后,与对照组相比,EPN3组HBV RNA表达水平没有明显变化;当HBV Epsilon缺失时,EPN3依然下调HBV RNA表达水平。4.当过表达p53时,EPN3表达水平上调,HBV RNA表达水平下调;沉默EPN3后,p53抑制HBV RNA作用减弱。5.用IFN-α处理细胞后,EPN3表达水平上调,HBV RNA表达水平下调;沉默EPN3后,IFN-α抑制HBV RNA作用减弱。结论1.EPN3抑制HBV复制。2.EPN3抑制HBV RNA依赖于转录过程,不需要HBV Epsilon的参与。3.EPN3在IFN-α和p53的下游并参与介导其抗HBV作用。
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