【摘 要】
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目的人体的各个器官表面都附着有大量的微生物,微生物群通过与宿主细胞之间的相互作用以保证机体正常的营养代谢和维持微生态稳定。金黄色葡萄球菌是造成医院获得性肺炎（hospital acquired pneumonia,HAP）的重要致病菌之一,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌给临床治疗带来了巨大的困扰,定植通常是其引起侵袭性疾病的第一步。以往的抗生素疗法容易打破呼吸道微生态平衡,同时增加了耐药菌株。人口
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目的人体的各个器官表面都附着有大量的微生物,微生物群通过与宿主细胞之间的相互作用以保证机体正常的营养代谢和维持微生态稳定。金黄色葡萄球菌是造成医院获得性肺炎（hospital acquired pneumonia,HAP）的重要致病菌之一,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌给临床治疗带来了巨大的困扰,定植通常是其引起侵袭性疾病的第一步。以往的抗生素疗法容易打破呼吸道微生态平衡,同时增加了耐药菌株。人口咽部生理性草绿色链球菌对近缘细菌产生拮抗和定植抗力,在平衡黏膜菌群和缓解炎症反应中发挥着作用。课题组在健康儿童口咽部分离得到对金黄色葡萄球菌存在拮抗作用的链球菌E24,本研究通过体外和体内实验进行其抑制金黄色葡萄球菌黏附人支气管上皮细胞16HBE细胞及在小鼠呼吸道定植的相关研究,探求E24潜在的益生性作用。方法（1）测定金黄色葡萄球菌与链球菌E24两株菌的生长曲线,制备试验所需浓度（1×10~5CFU/ml）的金黄色葡萄球菌和（1×10~7CFU/ml,1×10~8CFU/ml,1×10~9CFU/ml）的E24,分别与人支气管上皮细胞16HBE细胞共孵育30、60、90、120、150、180 min后,通过平板计数法观察细菌黏附细胞情况,同时通过革兰氏染色法和扫描电镜观察其黏附形态。细菌和细胞共孵育2、4、6、8 h,使用MTT试剂盒检测细胞活性;共孵育12 h,收集细胞上清液,ELISA试剂盒检测炎性细胞因子IL-6,IL-8,TNF-α水平。（2）采用雾化吸入的方式,给予小鼠金黄色葡萄球菌（10~5CFU/ml）和E24（10~8CFU/,10~9CFU/ml）,每隔1天采集小鼠咽拭子并涂板计数,并对甲型溶血性链球菌进行16Sr RNA鉴定,动态监测二者定植以及抑制定植的情况。实验结束后采集最后一天小鼠咽拭子进行高通量测序,收集小鼠血清,使用ELISA试剂盒检测炎性细胞因子IL-6,IL-8,TNF-α水平,并对小鼠气管和肺组织进行病理组织学观察。结果（1）菌株E24生长对数期在4～14 h,稳定期在14～22 h;金黄色葡萄球菌生长对数期在4～18 h,稳定期在18～24 h。E24在1×10~9CFU/ml,时间为120 min,其黏附力达到最高;金黄色葡萄球菌在1×10~5CFU/ml浓度下,时间为180 min时黏附力达到最高。E24和金黄色葡萄球菌在与16HBE细胞共培养120 min和180 min时,E24各浓度对金黄色葡萄球菌黏附率均有不同程度的抑制,其中在180 min,1×10~9CFU/ml浓度下抑制最明显（P＜0.0001）。与之对应浓度下,4 h时金黄色葡萄球菌组细胞活力下降（P＜0.05）,高剂量E24诱导细胞活力升高（P＜0.01）。E24与16HBE细胞共培养60 min时,菌体呈颗粒状黏附在细胞周围或表面,120 min时,菌体呈链状黏附于细胞周围,扫描电镜下更为清晰。金黄色葡萄球菌导致细胞炎性因子水平上升（P＜0.0001）,E24有效降低了TNF-α水平（P＜0.0001）。（2）持续雾化给予小鼠金黄色葡萄球菌14天后,再雾化给予不同浓度E24 8天,与单给小鼠金黄色葡萄球菌组比较,在第19、21、23天,金黄色葡萄球菌定植密度下降,21、23天抑制最明显（21天,金黄色葡萄球菌+E24中剂量组P＜0.0001,金黄色葡萄球菌+E24高剂量组P＜0.001;23天,金黄色葡萄球菌+E24中剂量组P＜0.0001,金黄色葡萄球菌+E24高剂量组P＜0.0001）。血清炎性因子检测结果提示高剂量的E24可以有效降低小鼠血清中TNF-α水平（P＜0.05）。通过病理学检查表明链球菌E24缓解了金黄色葡萄球菌所造成的炎症反应,同时在一定程度上维护了呼吸道微生态的平衡。结论链球菌E24能够抑制金黄色葡萄球菌黏附支气管上皮细胞16HBE,在动物实验中抑制了金黄色葡萄球菌在小鼠呼吸道的定植,并能发挥一定的免疫调节作用,维持呼吸道微生态平衡,具有潜在的益生性作用。
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