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研究背景和目的肝癌（liver cancer）是全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一,在全球癌症相关死亡中排第二位。在我国,肝癌每年新发病例和死亡病例占全球的50%以上,目前主要以手术及全身化疗等综合治疗方式为主,但患者预后仍不理想。同时肝癌发生发展的机制尚未完全明确,需要进一步探究。多聚嘧啶区结合蛋白1（PTBP1）是异质核糖核蛋白（hn RNPs）的亚家族成员之一,能够参与许多疾病的发生发展,PTBP1在大部分肿瘤中高表达,表明PTBP1可能作为促癌基因参与肿瘤的发生发展,有潜力成为一种新的肿瘤生物标志物及治疗靶点。本课题拟通过体内外实验明确PTBP1在肝癌发生发展过程中的作用,其次更深层次的探索其具体机制。这将为研究肝癌的发生发展提供新的思路,为肝癌早期的筛查及其治疗靶标提供新的理论依据。研究方法1.Uclcan在线软件分析PTBP1在正常组织及癌组织中的表达,随后下载TCGA肝癌RNA-Seq数据,对比PTBP1在肝癌组织与正常肝组织中的表达及不同分期、不同分级肝癌组织中表达,对比PTBP1高表达与低表达时总生存时间与无复发生存期;免疫组化实验证实PTBP1在癌旁组织及肝癌中的表达;Kaplan-Meier生存分析分析PTBP1表达量与肝癌患者预后的相关性;单因素分析PTBP1与肝癌临床特征的相关性;2.荧光定量PCR、Western blot检测PTBP1在正常肝细胞及肝癌细胞系中的表达量;用慢病毒系统构建敲低及过表达PTBP1的的肝癌细胞稳定株,并检测敲低及过表达PTBP1的效率;在稳定敲低及过表达PTBP1的肝癌细胞稳定株及对照组中,通过Transwell实验、细胞划痕实验、MTS、软琼脂克隆实验、平板克隆实验检测细胞侵袭、迁移、增殖的能力;3.免疫组化检测CD31在肝癌及癌旁组织中的表达,分析CD31与PTBP1在肝癌中表达的相关性;用慢病毒系统构建敲低PTBP1的血管内皮细胞稳定株,并检测敲低PTBP1的效率;在敲低PTBP1的血管内皮细胞稳定株及对照组中,通过Transwell实验检测细胞侵袭的能力;血管形成实验、细胞划痕实验、MTS实验检测PTBP1对血管内皮细胞的影响;4.用敲低PTBP1的肝癌细胞稳定株及对照组构建裸鼠皮下成瘤模型、裸鼠尾静脉注射转移成瘤模型、裸鼠肝原位成瘤模型,观察各个模型的成瘤情况;5.将敲低PTBP1的肝癌细胞稳定株及对照组进行高通量测序（RNA-Seq）,寻找差异表达及差异可变剪接的基因,通过q RT-PCR和RT-PCR鉴定差异表达及差异可变剪接的基因;6.通过Western blot、Transwell侵袭实验、MTS实验等研究PTBP1调控的差异的可变剪接的基因所涉及的信号通路及生物学功能;结果1.Uclcan在线软件分析TCGA数据显示在大部分肿瘤中PTBP1都呈高表达;在肝癌中,分期及分级越高,PTBP1的表达量越高;PTBP1表达量越高,总生存时间及无复发生存期越短;免疫组化结果显示PTBP1在肝癌中高表达,分期越高,PTBP1的表达量越高;Kaplan-Meier生存分析结果显示,PTBP1高表达较PTBP1低表达总生存时间短;单因素分析PTBP1与肝癌临床特征的相关性结果显示,PTBP1的表达量与肝癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、AFP血清高低指标、HBV/HCV有无感染无关,与临床分期有关;2.荧光定量PCR及Western blot显示,与肝正常细胞相比,PTBP1在肝癌细胞系中的表达量高;Transwell小室侵袭实验结果显示,敲低PTBP1可以抑制肝癌细胞的侵袭能力,过表达PTBP1可以促进肝癌细胞的侵袭能力;细胞划痕实验和Transwell无胶小室侵袭实验结果显示,敲低PTBP1可以抑制肝癌细胞的迁移能力,过表达PTBP1可以促进肝癌细胞的迁移能力;MTS、软琼脂克隆实验、平板克隆实验结果显示,敲低PTBP1可以抑制肝癌细胞的增殖能力,过表达PTBP1可以促进肝癌细胞的增殖能力;3.CD31与PTBP1的表达具有正相关性;Transwell小室侵袭实验结果显示,敲低PTBP1可以抑制血管内皮细胞的侵袭能力;培养敲低及过表达PTBP1的肝癌细胞稳定株的上清诱导血管生成实验及划痕实验结果显示敲低PTBP1后抑制血管生成及迁移能力,过表达PTBP1后促进血管生成及迁移能力;敲低及过表达PTBP1的肝癌稳定株与血管内皮细胞共培养诱导血管生成实验及MTS实验结果显示,敲低PTBP1后抑制血管生成及增殖能力,过表达PTBP1后促进血管生成及增殖能力;4.裸鼠皮下成瘤模型结果显示,敲低PTBP1可以抑制肝癌瘤体的生长;裸鼠尾静脉注射转移成瘤模型结果显示,对照组裸鼠的肝部及肺部有肉眼可见的多处瘤灶,相比于对照组,敲低PTBP1组裸鼠的肝部及肺部的瘤灶显著减少,敲低PTBP1抑制肝癌的侵袭转移;裸鼠肝原位成瘤模型结果显示,对照组裸鼠的肝部、肠系膜、肠部有肉眼可见的瘤灶,相比于对照组,敲低PTBP1组裸鼠的肝部、肠系膜、肠部的瘤灶显著减少,敲低PTBP1抑制肝癌的侵袭转移;5.将敲低PTBP1的肝癌稳定株及对照组的RNA-Seq进行分析,发现差异基因共518个,将下调的差异基因进行GO、KEGG分析,发现差异基因富集在MAPK通路、细胞增殖、细胞形态调节、信号传导等通路上;q RT-PCR证实了差异表达基因的测序结果;分析差异的可变剪接的基因结果显示,可变剪接有五种模式,主要是外显子跳跃（Skipped exon,SE）模式;RT-PCR证实了差异的可变剪接的基因测序结果;进一步分析发现,PTBP1调控差异的可变剪接的基因部分与MAPK信号通路有关,包括:MAPT、MAP4K4、FGFR3、MAP4K4、MAP2K5、MARK3;6.通过Western blot、敲低MAPT的肝癌细胞株及对照组后的生物学功能实验证实敲低MAPT可以抑制MAPK/Erk信号通路及生物学功能,说明PTBP1至少部分通过调控MAPT的可变剪接激活MAPK/Erk通路及肝癌的发生发展。结论1.PTBP1在肝癌中高表达且与预后差相关;2.PTBP1促进肝癌的增殖、侵袭、血管生成;3.PTBP1可通过调控MAPT、MAP4K4、FGFR3、MAP4K2、MAP2K5、MARK3的可变剪接激活MAPK/Erk通路,进而影响肝癌的发生发展。