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神经元纤维缠结和β-淀粉样蛋白(amyloid-beta peptides, Aβ)是诊断阿尔兹海默症(alzheimer’s disease，AD)的主要指标[1]。该疾病在老年人群的发病率极高，其症状也因人而异，发病前期出现短期记忆缺失、兴趣减退等；发病中期可见理解能力降低，病人偶尔出现早晨头脑清楚，到黄昏或光线变暗后变得头脑不清的“黄昏症候群”症状[2]；其晚期症状较为严重，出现智力低下，反应迟钝等临床表现。随着科技的发展，AD的病因受到了更多的关注，新靶点也不断被挖掘。目前仍然认为遗传和环境因素是主要病因，并且发现三种显性基因与少数家族性和早发性AD有关[3]，包括Amyloid Precursor Protein，Presenilin1，Presenilin2，晚发性AD只找到一个易感性基因,即APOE基因的ε4等位片段[4]；临床研究表明，健康的饮食习惯可明显降低AD的发病率[5]。目前针对AD疾病的药物治疗尚处于对症治疗阶段，主要包括增强胆碱神经功能药物和神经营养剂[6]。CNS的正常功能的发挥有赖于其生理结构[7]，AD疾病的发生严重地影响了神经元的结构和功能，因此针对该疾病的治疗第一步是了解CNS的组成，显然CNS存在大量的神经元聚集并构成回路[8]。CNS接受全身各处的传入信息，作为储存学习、记忆的神经基础，并进行整合加工。过去的研究多关注AD患者脑组织中神经元的损伤，对神经胶质细胞损伤的研究较少[1。作为CNS的重要部分,神经胶质细胞可以营养神经元并调节活性物质以维持大脑微环境[2]。少突胶质细胞(oligodendrocyte cells,OLs)是CNS的髓鞘形成细胞,其功能类似于外周神经系统的雪旺氏细胞[3],其形态特点为突起较多并可包绕若干神经纤维形成髓鞘和郎飞氏结的结构,加快神经冲动的传导和发挥绝缘作用[4]。体外培养该细胞呈现出明显的单极或双极突起[5]已有大量的研究关注AD与少突胶质细胞的关系,这为诊治该疾病提供了新的方向。以往的研究发现Aβ25-35作用于原代培养的SD乳鼠神经元后,抑制细胞生长,出现核质浓缩、胞质减少等形态学改变[6]；不仅如此,近年的研究表明它还影响髓鞘形成细胞OLs,在3xTg-AD模型小鼠中发现,Aβ寡聚体的病理改变早于白质功能的损伤和细胞病变。研究发现,β-淀粉样蛋白还可引起MBP表达的改变[7]。虽然已有大量研究提供了AD时CNS明显的髓鞘损伤的证据,但AD中影响髓鞘再生的因素及其修复的机制是什么?现在仍然缺乏明确的理论假设和实验证据的支撑。为了探讨β-淀粉样蛋白是否影响CNS的髓鞘再生和修复及其可能机制,本课题采用C57BL/6小鼠作为研究对象,同时选取该种系的正常和APP/PS1转基因小鼠,分别从整体水平、组织水平和细胞水平三个层面进行研究,实验设计将动物分为三组,包括正常对照组、空白对照组和实验组。在整体水平,主要观察Aβ1-42寡聚体对小鼠体重和平衡运动能力的影响。在组织水平主要观察小鼠脑胼胝体区MBP的表达情况。在细胞水平,主要观察Aβ1-42寡聚体对体外培养OPCs增殖和分化等方面的影响,在此基础上,通过检测Caspase-3表达的变化,观察Aβ1-42寡聚体可能通过凋亡途径影响OPCs变化的机制。研究内容包括三个部分：第一部分β-淀粉样蛋白对小鼠体重和平衡运动能力的影响1．实验设计和小鼠体重的称量实验分组前先对小鼠进行旋转棒(Rota-rod)训练，筛选表现较佳的30只6周龄，平均体重(15.42±0.53) g，雄性C57BL/6小鼠，且均由第三军医大学实验动物中心提供。然后随机将小鼠分为三组：正常对照组(10只)、空白对照组(10只)和实验组(10只)并进行不同的处理。实验组的处理如下：首先将溶解后的Aβ1-42于37℃的孵箱孵育7～10天，并在高倍镜下观察，确认纤维状的Aβ1-42寡聚体形成后，将2μl形成寡聚体的Aβ1-42定位注射于C57BL/6小鼠的第三脑室；空白对照组的处理方法与实验组一致，用无菌生理盐水替代Aβ1-42寡聚体；正常对照组则是不加任何干预的正常C57BL/6小鼠。通过对小鼠体重的称量观察Aβ1-42寡聚体对小鼠整体情况的影响，结果显示正常对照组小鼠的平均体重呈现出上升趋势，从第1周到第6周末平均体重由15.43±0.37g增至21.459±1.56g，净增7.029±1.19g；空白对照组小鼠平均体重增加趋势与正常对照组相似，从第1周到第6周末平均体重由15.41±0.49g增至21.415±1.77g，净增7.005±1.28g(P>0.05)；实验组小鼠在Aβ1-42寡聚体注射的2周内，平均体重呈现出下降趋势，由15.45±0.27g下降至11.193±0.61g，净下降了4.257±0.88g(P<0.05)；从第2周到第6周末，虽然小鼠平均体重有所上升，由11.193±0.61g增至14.122±0.98g，但相对于注射前的平均体重下降了1.328±1.25g(P<0.01)。上述结果表明Aβ1-42寡聚体注入小鼠脑内明显降低了小鼠的体重。2.旋转棒(Rota-rod)实验检测小鼠的平衡运动能力为了进一步探索Aβ1-42寡聚体对小鼠整体情况的影响，我们选用旋转棒(Rota-rod)实验观察小鼠平衡运动能力的改变。实验发现正常对照组和空白对照组小鼠的平衡运动协调能力均较好，正常对照组在旋转棒上的平均停留时间为159.02±23.01s，空白对照组为157.07±22.03s(P>0.05)。但实验组小鼠在旋转棒上的平均停留时间仅为80.49±19.72s(P<0.05)，可见小鼠在旋转棒上的平均停留时间明显缩短。上述结果表明Aβ1-42寡聚体注入小鼠脑内明显抑制了小鼠的平衡运动能力。第二部分：APP/PS1转基因小鼠脑胼胝体髓鞘的变化1.APP/PS1转基因小鼠APP/PS1转基因小鼠是被广泛应用于科学研究的AD模型小鼠[1]。以往的研究采用Morris水迷宫发现APP/PS1小鼠行为迟缓，寻找平台的潜伏期较长等[1]。该小鼠的学习记忆能力也显著低于正常C57BL/6小鼠[2]。可见APP/PS1转基因模型小鼠具有典型的阿尔兹海默症症状，但是该模型多用于学习记忆障碍的神经机制研究[3]，而较少关注此模型小鼠的髓鞘变化。2.脑胼胝体MBP的免疫组化染色相关研究表明Aβ42的产生和累积由APP的异常剪切造成[4]，当大量Aβ寡聚体产生后可在脑内堆积并形成老年斑[5]。可见，Aβ寡聚体的堆积严重影响了CNS正常的生理功能，作为神经元重要的包绕结构，髓鞘的异常也是关注的热点[6]。为了阐明Aβ寡聚体对髓鞘的影响，本实验采用IHC染色观察48周龄雄性APP/PS1转基因小鼠和正常的48周龄雄性C57BL/6小鼠胼胝体区MBP的表达，结果显示APP/PS1转基因小鼠MBP的荧光强度明显低于正常C57BL/6小鼠，表明β-淀粉样蛋白显著抑制了脑胼胝体髓鞘的再生与修复。第三部分：β-淀粉样蛋白对体外培养少突胶质前体细胞的影响1. OPCs的分离、纯化与鉴定采用B104条件培养的方法获取OPCs，该方法的第一步是原代培养出混合细胞，每次实验取3只0~3天SD大鼠的脑。培养3~5天后，在显微镜下出现较多球形细胞(OPCs)后，换用B104条件培养液增殖OPCs，最后吹打出细胞，全量更换增殖培养基扩增大量OPCs。最后采用免疫细胞化学染色方法(immunocytochemistry，ICC)鉴定OPCs确定其纯度大于95%。2.实验分组和细胞干预获得纯度较高的OPCs后，给予不同的干预条件，实验设计正常对照组，空白对照组和实验组。正常对照组只用增殖培养基而不进行干预；实验组则另外添加Aβ1-42寡聚体；空白对照组用等量体积的无菌水替代Aβ1-42寡聚体。细胞均接种于96孔板。3.细胞增殖率的检测Aβ1-42寡聚体以梯度时间((0，1，2，4，5h)对体外培养OPCs进行干预，采用CCK-8检测细胞存活率，发现仅加入5μmol作用1h后，细胞的存活率受到显著的抑制，并且随着时间的延长而增强(P<0.01)，虽然实验趋势细胞的D450值由0.26增至0.8(P<0.01)，但每个时间点的D450值下降(P<0.01)；而加入等量无菌水的空白对照组则无此作用(P>0.05)；Aβ1-42寡聚体以梯度浓度(0，1，2.5，5，10μmol)干预体外培养OPCs后，观察到4h后在1μmol的浓度时就显著抑制了细胞增殖，并且伴随浓度的增加其抑制作用越明显(P<0.01)，细胞的D450值由0.69降至0.39(P<0.05)。可见Aβ1-42寡聚体对OPCs具有时间和剂量性依赖的抑制作用。4. Aβ1-42寡聚体上调Caspase-3的表达水平对OPCs进行分组干预后，梯度时间点((0，1，2，4，5h)提取细胞总蛋白，采用Western Blotting检测Caspase-3的表达水平，发现实验组明显高于正常对照组和空白对照组(P<0.01),且呈现时间依赖性。同时，Aβ1-42寡聚体对OPCs进行不同浓度(0，1，2.5，5，10μmol)的干预后，提取细胞总蛋白检测Caspase-3表达量发现：2.5μmol的Aβ1-42寡聚体就促使了Caspase-3表达的上调(P<0.05),药物剂量越大Caspase-3表达水平越高(P<0.01)。5. Aβ1-42寡聚体对OLs形态的影响在体外培养3~5后，OPCs出现分化并形成外向延伸的大量突起，最终形成成熟的OLs。分别将正常对照组和实验组的细胞爬片固定后进行免疫细胞化学染色，观察细胞形态，发现正常细胞和加入Aβ1-42寡聚体处理的细胞有明显差异。正常细胞在低倍镜下可见细胞核密度适中并均匀分布，细胞体比较小且呈椭圆形，突起呈现为“蜘蛛网”状于胞体周围。实验组的细胞的形态出现改变：突起减少，核质浓缩且着色浅，整个胞体呈分散状。综上所述，本课题的研究结果表明：一、β-淀粉样蛋白抑制了小鼠的体重和平衡运动能力；二、β-淀粉样蛋白导致髓鞘碱性蛋白表达量下调；三、β-淀粉样蛋白抑制了OPCs的增殖和分化。四、β-淀粉样蛋白上调了Caspase-3的表达。以上结果提示β-淀粉样蛋白显著抑制了CNS髓鞘正常形成和生理功能，这种作用可能是通过凋亡途径抑制了OPCs的增殖和分化，从而影响了髓鞘修复。由此可见β-淀粉样蛋白在AD疾病的发生中通过影响髓鞘的再生修复而发挥作用，为阿尔兹海默症的临床治疗提供了新的方向。