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大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）既是肠道的共栖菌,也是兽医临床畜禽重要的革兰氏阴性致病菌,由致病性大肠杆菌引起的畜禽大肠杆菌病严重威胁着公共卫生安全与畜牧养殖业的健康发展。β-内酰胺类抗生素因其广谱性和高效性成为了治疗畜禽大肠杆菌病常用的一线药物,但随着其长期的大量使用,导致大肠杆菌耐药性越来越严重,甚至出现多重耐药。美罗培南（Meropenem,MEM）等碳青霉烯类抗生素被称为临床治疗多重耐药革兰氏阴性菌严重感染的“最后一道防线”,国内外尚未批准该类药用于动物养殖,但出现了大量的动物源碳青霉烯类耐药大肠杆菌。新德里金属-β-内酰胺酶-1（New Delhi Metallo-β-lactamase-1,NDM-1）的产生是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的最主要机制。NDM-1是金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamase,MBLs）中最重要的酶,能稳定高效水解除单环类之外几乎所有的β-内酰胺类抗生素,而目前临床应用的丝氨酸β-内酰胺酶（Serine-β-lactamases,SBLs）抑制剂对其无抑制作用。NDM-1具有耐药谱广、变异体多、易通过质粒水平传播的特征,已经成为筛选新型耐药酶抑制剂的重要靶标。筛选特异性靶向NDM-1酶的抑制剂是遏制“超级细菌”感染及保护β-内酰胺类抗生素有效性的最有效手段,而目前在临床治疗中尚无有效的NDM-1酶抑制剂。因此,本研究开展了NDM-1抑制剂的筛选、体内外协同抗菌活性评价及抑制机制的研究,旨在为NDM-1“超级细菌”感染防治提供理论研究基础和新策略。首先基于分子对接虚拟筛选NDM-1抑制剂。本研究应用计算机辅助药物设计的技术手段,利用Glide和Maestro筛选平台,以NDM-1（PDB:4EY2）为受体蛋白,采用半柔性对接方式,将Target Mol配体库中的小分子化合物分别与NDM-1的锌离子(Zn2+)活性中心进行分子对接并打分。将所有分子对接的受体-配体复合物的结合自由能由低到高进行排序,发现排序前100的对接复合物的吉布斯自由能均小于-9.0 kcal/mol。通过对受体-配体复合物结合模式分析发现:小分子化合物均结合在NDM-1的Zn2+活性中心,且与NDM-1活性中心的Zn2+及Cys、His、Asp等氨基酸残基形成了氢键、范德华力等多种相互作用力,极大的增加小分子化合物与NDM-1的亲和力,小分子化合物中的多种官能团和侧链片段起到了识别、定位NDM-1蛋白的关键作用,初步证明了本实验采用的分子对接虚拟筛选NDM-1抑制剂程序的正确性与可靠性。依据小分子化合物Lipinski类药性相关参数、均方根偏差（RMSD）值及配体效率等进一步筛选出30种候选抑制剂,其与NDM-1活性中心空间匹配且紧密结合形成较强相互作用力,活性效率较高,具有成为NDM-1有效抑制剂的潜力。建立NDM-1酶活性抑制体系进一步筛选有效的候选抑制剂,并对其进行体外抗菌活性评价。采用双酶切的方法构建[E.coli BL21（DE3）-p ET-32a（+）-NDM-1]重组表达系统,经诱导表达与层析纯化,获得浓度约为1.6 mg/m L且纯度大于90%的NDM-1重组蛋白。头孢硝噻吩（Nitrocefin,NIT）水解试验表明,与未加入NDM-1的对照体系的吸光度相比,加入NDM-1后,NIT被NDM-1水解后吸收波长由可见光谱区380 nm跃迁到492 nm处,体系颜色也由黄色变为红色,OD492nm随时间增加明显升高,且线性关系良好,表明重组蛋白NDM-1酶解活性较高。在此基础上构建NDM-1酶活性抑制体系,对30种候选抑制剂进一步筛选,获得四种了生物活性较好的抑制剂Amifostine（AMI）、Phthalylsulfacetamide（PSA）、Vidofludimus（VFM）和Betaxolol（BET）。四种酶抑制剂对NDM-1酶活性抑制呈极显著的剂量依赖（P＜0.01）,抑制率分别为83.7%、93.3%、89.2%、87.5%,IC50分别为25.4±0.6、13.8±0.5、15.4±0.3、19.3±0.9μM,表明这四种化合物对大肠杆菌携带的NDM-1酶水解活性具有显著抑制作用。通过最小抑菌浓度（MIC）、分级抑制浓度指数（FICI）,生长曲线和时间-杀菌曲线试验,测定了四种抑制剂与MEM联用的体外抗菌活性,结果表明四种抑制剂本身对NDM-1阳性大肠杆菌生长无显著影响,但与MEM联合用药时能够使降低MEM对NDM-1阳性大肠杆菌得MIC值降低4-32倍。四种抑制剂与MEM联合用药能够有效增强MEM对NDM-1阳性大肠杆菌的抗菌活性,有显著的协同作用（FICI＜0.5）,FICI分别为0.375、0.156、0.125、0.25,其中PSA、VFM与MEM的协同效果最佳。为了进一步研究PSA或VFM与MEM联合用药在体内是否有协同抗菌作用,在建立BALB/c小鼠的NDM-1阳性大肠杆菌全身感染模型基础上,进行了PSA或VFM与MEM联合用药的有效剂量筛选和体内治疗学试验。首先通过比较分析不同剂量处理组小鼠的白细胞计数、靶器官菌落定植、炎症因子含量测定,确定了PSA、VFM分别以20 mg/kg、10 mg/kg剂量与MEM联合用药时效果最佳,且该有效剂量对宿主细胞无明显毒性。随后在确定的有效剂量下,通过保护率、白细胞计数、靶器官菌落定植、炎症因子含量测定、靶器官组织病理学和超微结构观察等指标,评价了PSA或VFM联用MEM的体内协同效果。结果表明,与感染对照组、PSA、VFM单抑制剂组、MEM单抗生素组相比,PSA或VFM与MEM联合用药显著提高了NDM-1阳性大肠杆菌感染小鼠的存活率（P＜0.05）,降低了靶器官肝脏、脾脏、小肠中NDM-1阳性大肠杆菌的定植数量及血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ炎症因子的水平（P＜0.05）,并有效缓解了感染小鼠靶器官肝脏、脾脏、小肠的病理性损伤。确证了PSA、VFM单独用药对NDM-1阳性大肠杆菌感染小鼠无治疗作用,MEM单独用药治疗效果较弱,而PSA或VFM与MEM联合用药具有显著的协同治疗效果。为了探究PSA和VFM对NDM-1的抑制机制,首先通过蛋白免疫印迹试验和圆二色光谱试验,发现PSA和VFM自身既不会影响NDM-1蛋白的表达,对NDM-1蛋白的二级结构与热稳定性也无明显影响。然后对PSA和VFM与NDM-1复合物体系进行分子动力学模拟,结果发现复合物体系RMSD平均值只有2.0?左右,揭示了在动力学模拟过程中NDM-1蛋白的主链原子的位移偏移较小,且复合物体系能在较短时间内达到动态平衡状态。MM/GBSA结合自由能与自由能分解计算表明复合物体系总的结合自由能中主要来自于ΔEvdw,PSA和VFM可稳定结合在NDM-1的活性水解中心并与Zn2+及氨基酸结合而产生相互作用,其中PSA与氨基酸残基Phe70、Val73、His122、Ile221形成较强的相互作用,VFM则与氨基酸残基Met67、His120、His122、His250形成较强的相互作用。为了验证分子动力学模拟的结果,将PSA和VFM与NDM-1复合物体系中对结合自由能贡献较大的氨基酸残基Val73/His122、Met67/His120定点双突变成惰性氨基酸Ala。通过酶活性抑制、荧光淬灭及分子对接试验比较分析野生型与突变型NDM-1的差异,结果表明PSA和VFM对野生型NDM-1活性抑制作用极显著强于突变型NDM-1（P＜0.01）,PSA和VFM与野生型NDM-1的结合能力和结合概率大于突变型NDM-1,证实了PSA和VFM是通过与NDM-1活性中心的关键氨基酸结合而抑制了NDM-1酶的水解活性,起到竞争抑制作用。最后应用Octet RED96生物膜层干涉技术进行了PSA和VFM与NDM-1分子互作,发现抑制剂PSA和VFM是通过与NDM-1蛋白直接结合而产生相互作用,且二者具有较强的亲和力。因此,小分子抑制剂PSA和VFM的作用机制为竞争性抑制。综上所述,本研究通过分子对接虚拟筛选出PSA和VFM两个新型的NDM-1潜在抑制剂,可显著抑制NDM-1酶的水解活性,显著增强MEM对NDM-1阳性大肠杆菌的抗菌活性,体内外与MEM联合用药对NDM-1阳性大肠杆菌呈现显著协同抗菌作用,并揭示了其竞争性抑制的作用机制,研究结果为靶向“超级细菌”NDM-1特异性抑制剂的开发以及耐药菌的感染防治提供了研究基础和新策略。