【摘 要】
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目的:研究亨廷顿蛋白(Hungting, Htt)氨基末端片段-- Htt-552片段和Htt-171片段对CRE介导的基因转录的影响,评估该基因转录调节通路在亨廷顿舞蹈病致病机制中的作用。方法:采
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目的:研究亨廷顿蛋白(Hungting, Htt)氨基末端片段-- Htt-552片段和Htt-171片段对CRE介导的基因转录的影响,评估该基因转录调节通路在亨廷顿舞蹈病致病机制中的作用。方法:采用脂质体转染的方法将pGL4[luc2P/CRE/Hygro]荧光素酶基因报告质粒转染到PC12细胞中,经过潮霉素筛选后得到稳定表达该质粒的PC12细胞(简称为PC12-CRE)。用腺病毒介导野生型与突变型Htt-552片段和Htt-171片段感染的方法制作亨廷顿舞蹈病的PC12-CRE细胞模型。利用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其荧光值,观察突变型Htt-552片段和Htt-171片段在正常情况下以及细胞应激情况下对CRE介导的基因转录的影响。用Real-time PCR的方法检测Htt-552片段和Htt-171片段对BDNF mRNA表达的影响。结果:稳定表达pGL4[luc2P/CRE/Hygro]质粒的PC12细胞构建成功。腺病毒成功介导野生型与突变型Htt-552片段和Htt-171片段在PC12-CRE细胞中表达。免疫组织化学结果显示Htt-552片段在细胞内主要分布于细胞浆,细胞核内表达较少,无聚集体形成,而Htt-171片段尤其是突变型在胞浆中有大量聚集体产生,胞核中表达较少,无聚集体。免疫组化结果显示Htt-552片段和Htt-171片段在核内与CBP仅存在微弱的共定位。荧光素值结果显示突变型Htt-552片段和Htt-171片段对cAMP反应元件调节的转录无影响。即使在环境应激情况下,包括添加3-硝基丙酸(3-NP)、海人藻酸(KA)、多巴胺(Dopamine)、金属离子(CuSO4、FeSO4.7H2O)和NH4Cl,突变型Htt-552片段和Htt-171片段对cAMP反应元件相关性转录也无影响。野生型Htt-552片段和Htt-171片段上调BDNF mRNA的表达,而突变型下调其表达。结论:突变型Htt-552片段和Htt-171片段无论是在正常情况或某些细胞应激情况下对cAMP反应元件相关性转录均无影响。突变型Htt-552片段和Htt-171片段降低了BDNF的表达。
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