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目的:本试验通过构建癌性恶病质(cancer cachexia CC)动物模型,观察经吲哚美辛(IN)干预后,癌性恶病质小鼠腓肠肌中MAFbx/Atrogin-1和MuRF1因子表达变化,初步探讨MAFbx/Atrogin-1和MuRF1因子在CC肌肉萎缩中作用机制及吲哚美辛可能的逆转机制。
方法:选取44只健康雄性BALB/c小鼠(体重:18-22g,周龄;6～8w)随机分成4组:健康对照组(HC组):(8只)、恶病质组(CC组):(12只)、吲哚美辛组(IN组):(12只)、甲羟孕酮组(MPA组):(12只)。将鼠结肠腺癌26(colon26)细胞株接种于BALB/c小鼠右腋窝皮下,构建癌性恶病质动物实验模型[1]。荷瘤第15天,全部小鼠进入恶病质状态。IN组开始腹腔注射吲哚美辛(1.0mg·kg-1·d-1)、CC组给予等量生理盐水腹腔注射、MPA组甲羟孕酮灌胃(30 mg·kg-1·d-1),连续用药一周后,期间监测各组小鼠精神、活动状态、毛色、体重、摄食量及饮水量的变化。至第22天脱颈椎处死HC组、CC组、IN组、MPA组各8只小鼠并留取标本。各组余下4只小鼠继续给药,注射剂量、注射次数不变,观察各组小鼠的生存时间。应用放免法测定血清中细胞因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子a(TNF-α)的水平,称量腓肠肌湿重,Braford法测定腓肠肌总蛋白含量,应用显微镜测量腓肠肌纤维横截面积及应用RT-PCR法测定小鼠腓肠肌中MAFbx/Atrogin-1和MuRF1因子的水平变化并记录各组小鼠的生存时间。观察比较这些指标在各组小鼠之间的差异。用SPSS13.0统计学软件进行数据处理,各组数据均以x±s的形式表示。两个独立样本组间均数比较采用t检验,多组的组间均数比较采用方差分析(one-wayANOVA)。
结果:
1动物模型将colon26癌细胞接种于各组小鼠皮下,4-5天后各荷瘤组皮下可触及瘤结节,荷瘤小鼠精神、活动状态、毛色等一般状况无明显变化,之后肿瘤进行性增大,荷瘤15天后,小鼠开始出现精神差,活动量减少全身皮毛杂乱无序,摄食、饮水量相对减少,去瘤体重下降10％以上,即进入癌性恶病质状态。随着各组用药干预后,荷瘤小鼠上述情况均有不同程度的好转。
2去瘤体重及瘤体重量实验开始时,各组间小鼠体重无统计学差异(P＞0.05)。荷瘤第15天,CC组摄食量饮水量及一般状况恶化明显,小鼠去瘤体重较HC组明显降低(P＜0.05)。IN组终末去瘤体重较CC组增加(P＜0.05),有统计学意义,与MPA组相比无统计学意义(P＞0.05)。各治疗组的瘤体重量较CC组减轻,差别无统计学意义(P＞0.05)。
3细胞因子各荷瘤组小鼠血清中IL-6、TNF-α浓度较HC组明显升高(P＜0.05),差别有统计学意义。药物干预后后,IN组、MPA组小鼠血清中IL-6、TNF-α浓度较CC组显著降低(P＜0.05)。组间比较,IN组小鼠血清中IL-6、TNF-α浓度与MPA组比降低,差异无统计学意义(P＞0.05)。
4腓肠肌湿重各组荷瘤小鼠腓肠肌湿重较HC组有明显下降(P＜0.05);药物治疗后IN组小鼠腓肠肌湿重明显大于CC组(P＜0.05);与MPA组相比小鼠腓肠肌湿重增加,无统计学意义(P＞0.05)。
5腓肠肌总蛋白含量各组荷瘤小鼠腓肠肌总蛋白含量较HC组明显下降(P＜0.05);IN组小鼠腓肠肌总蛋白含量上升大于CC组(P＜0.05);与MPA组相比小鼠腓肠肌总蛋白含量增加,无统计学意义(P＞0.05)。
6腓肠肌横截面积:各组荷瘤小鼠腓肠肌横截面积较HC组明显降低(P＜0.05),其中CC组最明显;药物干预后IN组小鼠腓肠肌横截面积明显大于CC组(P＜0.05);与MPA组比较,IN组小鼠腓肠肌横截面积增加,差别无统计学意义(P＞0.05)。
7腓肠肌中MAFbx/Atrogin-1和MuRF1因子表达:各组荷瘤小鼠腓肠肌中MAFbx/Atrogin-1和MuRF1因子表达水平明显高于HC组(P＜0.05),药物干预后,IN组小鼠腓肠肌中MAFbx/Atrogin-1和MuRF1表达较CC组明显降低(P＜0.05),差别有统计学意义;与MPA组比较MAFbx/Atrogin-1和MuRF1表达水平降低(P＞0.05),差别没有统计学意义。
8生存时间CC组小鼠中位生存时间为27.2天,明显缩短;治疗后IN组、MPA组小鼠中位生存时间较CC组延长(P＜0.05),IN组与MPA组间比较无统计学意义(P＞0.05)。
结论:
1癌性恶病质肌肉萎缩时小鼠血清中细胞因子IL-6、TNF-α浓度明显升高,提示IL-6、TNF-α等细胞因子与肌肉萎缩的发生密切相关,是激活肌肉萎缩途径的重要因素之一。
2癌性恶病质小鼠骨骼肌中MAFBx/atrogin-1、MuRF1因子高表达,对泛素-蛋白酶体途径有激活作用,进而诱导骨骼肌萎缩,导致骨骼肌重量及横截面积下降,提示MAFBx/atrogin-1、MuRF1因子在骨骼肌萎缩中起重要作用。
3中剂量吲哚美辛可以降低血清中的细胞因子IL-6、TNF-α活性,下调MAFBx/atrogin-1、MuRF1因子表达,抑制ATP-泛素-蛋白酶途径的激活,发挥抗恶病质肌肉萎缩作用。
4甲羟孕酮和吲哚美辛均能够增加恶病质小鼠的终末去瘤体重,延长恶病质小鼠的生存期,不同程度缓解骨骼肌萎缩,但甲羟孕酮的作用没有吲哚美辛明显。