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目的： 妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是以皮肤瘙痒和黄疸为主要临床症状，血清胆酸升高为主要生化特征的妊娠期疾病，常发生于妊娠中晚期。ICP孕妇预后良好，但是对胎儿危害很大，可引起胎儿宫内窘迫、早产、死胎、死产等严重并发症。目前，学者们普遍认为ICP发病可能与免疫失衡、雌激素代谢异常、遗传、基因等因素有关，但其机制尚未明确。故进一步研究ICP病理生理机制，深刻认识ICP导致胎儿死亡的原因，是预防ICP发生不良妊娠结局的关键。 胎盘是母儿进行物质交换的重要器官，胎盘功能障碍可干扰孕妇与胎儿间胆汁酸的正常转运。研究表明，随着ICP病程进展，高胆酸包括石胆酸(lithocholic acid，LCA)、牛磺胆酸(taurocholic acid，TCA)、脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)等可引起胎盘功能严重受损，导致胎儿急性宫内窘迫甚至突然死亡。研究发现，ICP患者胎盘中合体结节明显增多，绒毛滋养细胞凋亡增加，凋亡相关蛋白表达上调。 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinases，PIKKs)家族成员。mTOR在进化上相对保守，可整合营养、能量及生长因子等多种细胞外信号，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成和细胞凋亡等生物过程，在细胞生长中发挥极为重要的作用。mTOR在细胞中存在两种不同的复合物形式，分别为mTOR复合物1(mTOR Complex1，mTORC1)和mTOR复合物2(mTOR Complex2，mTORC2)。mTORC1主要通过磷酸化其下游靶蛋白40S核糖体蛋白S6激酶l(p70ribosomal protein S6kinases，S6K1)及真核细胞翻译起始因子4E-结合蛋白-1（eukaryotic initation factor4E binding protein1，4E-BP1）来调节下游蛋白翻译。mTORC2能磷酸化下游蛋白Akt的丝氨酸473位点(Ser473)，从而控制细胞存活。研究显示，mTOR是调控内质网应激的重要上游信号，严重的内质网应激可导致细胞凋亡。 内质网是细胞主要的钙储存库，也是蛋白质折叠、脂质生物发生的场所，在维持细胞内环境稳定的过程中起着关键作用。能量或营养缺乏、钙稳态失衡、机体氧化还原状态改变等病理情况都可破坏内质网的自我平衡能力，引起蛋白的错误折叠，进而激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。过强的UPR会引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress），导致细胞凋亡的发生。研究表明，在肝内胆汁淤积症中亲脂性胆酸可激活内质网应激，导致肝细胞受损。然而，内质网应激在ICP发病机制中的作用鲜有报道。本研究拟探讨mTOR信号通路和内质网应激在ICP发生发展中的作用和机制。 方法： 1.体内实验 (1)ICP胎盘组织形态学观察：选择南方医科大学附属南方医院2015年12月至2016年12月住院分娩的ICP孕妇20例为研究对象，另以同期因社会因素行择期剖宫产术的20例无合并症的正常孕妇为正常对照组。光学显微镜下观察ICP组和正常妊娠组胎盘组织石蜡切片的HE染色玻片，统计各组合体细胞结节数量。 (2)免疫组织化学法研究：通过免疫组织化学方法检测ICP组和正常妊娠组胎盘组织中p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)的表达水平;测定切片平均光密度值，半定量胎盘中p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)的表达量。采用SPSS17.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用ANOVA检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。 2.体外实验 (1)用不同浓度梯度、时间梯度的LCA、TCA及UDCA分别处理人早孕滋养细胞HTR-8/SVneo。 (2)用LCA和雷帕霉素或渥曼青霉素共处理HTR-8/SVneo细胞。 (3)通过蛋白免疫印迹方法检测HTR-8/SVneo细胞中p-S6K1(T389)、p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)、IRE1α和Bip蛋白的表达量。 (4)用不同浓度LCA处理HTR-8/SVneo细胞，Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞活性。 (5)用LCA与雷帕霉素或渥曼青霉素共处理HTR-8/SVneo细胞，CCK8检测细胞活性。 结果： (1)人ICP胎盘组织学变化 相较正常妊娠组胎盘，ICP可致绒毛合体结节增多、细胞滋养层细胞增生肿胀、绒毛间质水肿伴空泡形成和绒毛纤维素样坏死。 (2)人ICP胎盘组织中mTOR信号通路的免疫组织化学研究 p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)蛋白主要表达于胎盘滋养细胞的胞浆。光学显微镜下观察，与正常妊娠组比较，ICP组胎盘组织中p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)明显增加。IOD/AREA半定量分析差异有统计学意义(P＜0.01)。 (3)HTR-8/SVneo细胞分别与LCA、TCA、UDCA培养，蛋白免疫印迹方法检测p-S6K1(T389)、p-S6(S235/236)和p-Akt(S473)蛋白的表达 与对照组比较，HTR-8/SVneo细胞与10、15、20、30、40μM LCA培养1.5h后，p-S6K1(T389)、p-S6(S235/236)和p-Akt(S473)蛋白的表达量增加。HTR-8/SVneo细胞与20uM LCA培养0.5、1、1.5、2、4h后，p-S6K1(T389)、p-S6(S235/236)和p-Akt(S473)蛋白的表达量也较对照组增加。但是，HTR-8/SVneo细胞与TCA或UDCA培养，p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)蛋白的表达量与对照组相比，无明显差异。HTR-8/SVneo细胞分别与LCA、TCA、UDCA培养后，S6、Akt、Actin蛋白的表达量未受影响。 (4)HTR-8/SVneo细胞与LCA和雷帕霉素或渥曼青霉素培养，蛋白免疫印迹方法检测p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)蛋白的表达 HTR-8/SVneo细胞与100nM雷帕霉素和15、20、30uM LCA培养2h后，p-S6(S235/236)蛋白表达明显下降至对照组水平，然而，p-Akt(S473)蛋白表达较对照组明显增加。HTR-8/SVneo细胞与1uM渥曼青霉素和15、20、30uM LCA培养2h后，p-S6(S235/236)、p-Akt(S473)蛋白表达均明显下降，与对照组水平无明显差异。HTR-8/SVneo细胞与雷帕霉素或渥曼青霉素培养后，S6、Akt、Actin蛋白的表达量未受影响。 (5)HTR-8/SVneo细胞与LCA培养，蛋白免疫印迹方法检测IRE1α、Bip蛋白的表达 与对照组比较，HTR-8/SVneo细胞与20uM LCA培养1、3、6h后，IRE1α、Bip蛋白的表达量均较对照组增加。 (6)HTR-8/SVneo细胞与LCA和雷帕霉素或渥曼青霉素培养，蛋白免疫印迹方法检测IRE1α、Bip蛋白的表达 20uM LCA与100nM雷帕霉素或1uM渥曼青霉素共处理HTR-8/SVneo细胞1h、3h、6h后，20uM LCA+100nM雷帕霉素处理组中BiP蛋白表达在刺激3h和6h后明显下降，IRE1α表达无明显变化;20uM LCA+1uM渥曼青霉素处理组中IRE1α、Bip蛋白表达均在处理1h、3h和6h后明显下降，与对照组水平无显著差异。 (7)HTR-8/SVneo细胞与LCA培养，CCK8检测细胞活性 与对照组比较，HTR-8/SVneo细胞与5、10、15、20、30μM LCA培养，当处理浓度在5、10uM时，HTR-8/SVneo细胞存活率与对照组相比无明显变化，然而，当处理浓度在15、20、30uM时，HTR-8/SVneo细胞存活率明显下降。 (8)HTR-8/SVneo细胞与LCA和雷帕霉素或渥曼青霉素培养，CCK8检测细胞活 20uM LCA与100nM雷帕霉素或1uM渥曼青霉素共处理HTR-8/SVneo细胞1h、3h、6h后，细胞在处理3h和6h后死亡均较前缓解。 结论： 1.mTOR信号通路活化引起内质网应激在ICP的发生发展中起着重要作用。 2.不同类型的胆酸对于mTOR信号通路的影响不同。LCA可以激活mTOR信号通路，而TCA、UDCA对mTOR信号通路无明显影响。 3.LCA与HTR-8/SVneo细胞体外培养可激活mTOR信号转导通路，引起内质网应激，导致细胞死亡。