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目的:采用位点特异性荧光蛋白标记技术建立新型示踪MHC-I类分子的方法,并比较不同标签在体细胞和抗原递呈细胞中示踪MHC-I类分子的优缺点。 方法:(1)构建H-2Kb-EGFPTCtag和H-2Kb-TCtag真核慢病毒表达载体,转染293FT细胞制备病毒H-2Kb-EGFPTCtag和H-2Kb-TCtag,将病毒分别感染体细胞293FT和树突状细胞系DC2.4细胞后,分别采用染料ReAsH和FlAsH染色,在激光共聚焦显微镜下观察H-2Kb的分布情况;(2)H-2Kb-TCtag转染293FT细胞,采用染料 ReAsH染色,在激光共聚焦显微镜下观察 H-2Kb的分布情况;(3)构建 H-2Kb-halotag融合蛋白的真核慢病毒表达载体,转染293FT细胞制备病毒,将病毒分别感染体细胞293FT、树突状细胞系 DC2.4细胞以及DC2.4-FUKY细胞后,采用染料HaloTag TMR染色,在激光共聚焦显微镜下观察H-2Kb的分布情况;(4)构建H-2Kb-halotagout融合蛋白的真核表达载体,转染293FT细胞,采用染料HaloTag®Alexa488染色,在荧光显微镜下观察293FT细胞膜上的H-2Kb的表达分布。 结果:(1)在激光共聚焦显微镜下观察到了在293FT细胞中kb-EGFP-Tctag融合蛋白与ReAsH染色的kb-Tctag融合蛋白、kb-EYFP-halotag与染料HaloTag® TMR都是是共定位的,证明了Tctag与染料ReAsH、kbhalotag与染料HaloTag® TMR是特异性结合,并且都不会影响kb的分布表达;(2)在激光共聚焦显微镜下观察到了在非APC细胞293FT细胞中,tctag和halotag都是特异性标记MHC I类分子;(3)在激光共聚焦显微镜下观察到了在APC细胞DC2.4细胞中,tctag是非特异性标记MHC I类分子,而halotag是特异性标记MHC I类分子的;(4)在荧光显微镜下观察到293FT细胞膜上的H-2Kb的表达分布。 结论:本研究成功地建立了新型的特异性标记MHC I类分子的方法,并研究了此两种方法在标记过程中的特性。结果证明此两种方法操作过程简单、方便、并对目的蛋白表达分布没有影响。但它们各有优缺点,即Tctag只在非APC细胞中特异性标记蛋白,而halotag则在APC和非APC细胞中都是特异性标记蛋白。另外,Tctag比 halotag小得多,更适合标记小分子。因此,可以根据研究的需要进行选择从而实现对多种蛋白进行标记。