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植物内生菌不仅是发现新化合物和新药物的重要资源,而且可通过多种方式促进宿主生长、提高宿主植物对环境胁迫的抗性、植物的生存力和种间竞争力,在农业、工业、环保和医药业中具有重要的应用前景。高良姜(AlpiniaofficinarumHance)是一种热带多年生的山姜属食药兼用植物,是世界著名汉药二天油、驱风油、清凉油(万金油)最主要原料来源。目前,高良姜的研究主要集中在对其化学成分、药理和药效以及道地高良姜品质鉴定等方面,关于高良姜内生菌的研究尚未有报导。本论文以道地高良姜产地徐闻龙塘高良姜为研究材料,开展其内生菌种群多样形态和功能多样性研究。其主要研究内容和研究结果如下: 1.道地高良姜不同生长年份主要活性成分的含量测定采用水提法、水提-气相色谱分析法、甲醇抽提-HLPC法分别测定1~4年道地高良姜同一组织(块根)3种指标性活性成分总挥发油、桉油精和高良姜素的含量。结果表明所测3种活性成分均随高良姜栽培年份延长而增加。 2.高良姜可培养内生菌菌落丰富度的时间、空间差异分析采用无菌条件研磨-梯度稀释法对高良姜内生菌种群数量测定,结果表明高良姜内生细菌、内生真菌菌落丰富度为1.20×104~6.0×105、0.80×104~4.67×104cfu/g鲜重。在不同组织,道地高良姜内生细菌、内生真菌菌落丰富度依次为块根、茎段和叶片。不同生长年份道地高良姜所有组织的内生细菌、内生真菌菌落丰富度随栽培年份的增加而增加。 3.道地高良姜可培养内生菌的分离纯化和初步鉴定挑选分离平板上菌落特征存在差异的内生菌菌落进行分离和纯化,共得到103个菌株,其中细菌67株,共归于12个不同的属;真菌36株中,已有29株确定到属,归于14个属;4Y015-4、3B002、2Y011、2Y001、2B028、1K001等6个菌株只能鉴定到纲,它们均属于子囊菌纲(Ascomycota)。 4.道地高良姜不同生长年份内生菌种群差异比较道地高良姜内生菌种群组成和优势种群随栽培年份的不同而存在差异。1~4年生内生细菌种群数目分别为1、4、6和6。1~4年生内生真菌种群数目分别为4、5、7和5。 5.道地高良姜内生菌功能多样性研究以产胞外水解酶(几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶)潜力、产生长素以及高良姜素潜力为功能活性指标,对所有103株道地高良姜内生菌进行生物活性菌株筛选。22株(21.4%)菌株具有产几丁质酶潜力,其相对活性(透明圈直径H和菌落直径C之比)在1.10到1.80之间;54株(52.9%)菌株具有产葡聚糖酶潜力,其相对活性在1.03到7.20之间;51株(49.5%)菌株具有产蛋白酶潜力,其相对活性在1.09到3.88之间;21株(20.4%)菌株具有产纤维素酶潜力,其相对活性在1.07到3.71之间;46株(44.7%)菌株显示生长素产生潜力:1个菌株(0.97%)菌株显示了高良姜素产生潜力。 6.以白色假丝酵母、尖孢镰刀菌作为指示真菌,对高良姜中分离得到的60株内生菌进行抗真菌资源初筛,结果显示有35%的菌株对测试真菌有不同程度的拮抗活性。其中,4个菌株(2B012、2B013、3B005、4K020-2)的胞外代谢产物样品对白色假丝酵母具有较强的抗真菌活性,在原始浓度下对白色假丝酵母的抑菌圈直径均达20mm以上;4个菌株(1Y012、1Y013、2K018、2B013)的胞外代谢产物样品对镰刀菌具有较强的抗真菌活性,在原始浓度下对镰刀菌的抑菌圈直径均达20mm以上。 本论文研究结果显示高良姜内生菌具有丰富的种群多样和功能多样性。随着高良姜有效成分合成的增加,其内生细菌菌落丰富度与种群丰富度相应增加,提示高良姜内生细菌与该药用植物宿主具有协同进化、互惠共生的生态关系。