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本论文分两章，第一章为通过体细胞核移植获得多基因修饰克隆猪的研究，第二章为猪死亡相关蛋白THAP11的分子克隆及功能研究。
通过体细胞核移植获得多基因修饰克隆猪的研究转基因猪在农业、人类疾病模型及异种移植领域的运用价值日益凸显。然而，在农业上，一种优良性状往往涉及到多个基因的协调控制；作为某些人类疾病模型时，对多个基因进行修饰是有效模拟疾病在人体内发生发展规律的必要前提；异种器官移植后，所面临的异种排斥反应是由众多免疫调节因子共同参与调节的。所以，对猪的基因组进行多基因修饰具有重大意义。目前，已报道的绝大部分多基因修饰猪是通过多个单转基因猪交配选育而成，这种方法往往费时费力，效率低下。因此，试图探索高效快速生产多基因修饰猪的技术体系。作为体细胞核移植常用的供体细胞，猪胎儿成纤维细胞(PFF)具有在体外分裂增殖速率相对较快的特点，因此认为PFF同时接受多个外源基因的能力较强。根据这一推论，首先采用多个独立质粒共转法生产多基因修饰克隆猪。将四个独立的荧光蛋白表达载体通过电转到PFF，通过G418筛选后，获得了表达四种荧光蛋白的细胞，以这些细胞作为供体细胞进行体细胞核移植，获得了表达四种荧光蛋白的重构胚。随后将体外重构配移植到6头代孕母猪体内，其中3头妊娠足月，共产下6头克隆小猪。通过组织切片观察，可见所检测的组织内均表达四种荧光蛋白，但是在同一组织中不同荧光蛋白的表达水平存在差异，在不同的组织之间，同一荧光蛋白的表达水平也存在差异。因此，这种方法虽然能够将多个外源基因转到动物之中，但存在多基因协同表达的问题。最近，在基因治疗和诱导多能干细胞领域，来源于病毒的2A肽在介导多基因转移及其协同表达上显示出独特的优越性。所以，我们探索了利用2A肽生产多基因修饰克隆猪的可行性。首先，构建了基于2A肽的双启动子表达载体pZCpTG，用于介导四种荧光蛋白的表达。线性化的pZCpTG通过电转到PFF，通过G418筛选后，54.3％的细胞克隆同时高水平表达四种荧光蛋白。以此细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植获得的体外重构胚也同时表达此四种荧蛋白。随后，将体外重构胚移植到7头代孕母猪体内，其中2头代孕母猪妊娠足月，产下11头多基因修饰克隆猪。这11头克隆猪中，有7头共表达四种荧光蛋白，并且表达水平一致。通过活体荧光观察仪goggles，可以直接观察到这些克隆猪的鼻镜、蹄及舌发荧光。实验结果表明利用2A肽和双启动子巧妙地将四种不同的荧光基因放在一个表达载体上，只通过一轮动物克隆即可成功获得含多个外源转基因的克隆猪，不仅克服了体细胞多基因转移的技术障碍，而且实现了多个外源转基因高水平地协同表达。工作为获得多基因修饰猪提供了一种高效的方法，为今后加速对猪的遗传性状进行转基因改良，提高其生产性能，并为制作用于人类疾病动物模型以及作为人类器官移植供体的多基因修饰猪的研究奠定了坚实的理论基础和技术基础。
猪死亡相关蛋白THAP11的分子克隆及功能研究死亡相关蛋白(THAPs)是一类新的DNA结合蛋白家族，其广泛参与细胞生命活动，跟细胞增殖、细胞周期、染色质修饰、转录调节和干细胞多能性均相关。THAP11，作为该蛋白家族的一员，可通过转录抑制c-MYC表达，从而抑制细胞增殖。在小鼠，THAP11则被认为是维持小鼠胚胎干细胞多能性的关键因子。在本文中，克隆了猪THAP11的cDNA序列，通过同源性分析，发现猪THAP11在DNA及蛋白水平上与人、牛及小鼠的THAP11高度相似。通过实时定量PCR发现，猪THAP11广泛表达于多种组织和器官中。在四环素诱导表达猪THAP11的细胞系中，发现过量表达猪THAP11导致细胞增殖抑制及CyclinD1表达下调。更重要的是，发现过表达猪THAP11显著抑制ERK1/2的磷酸化及激活，而ERK1/2是Cyc1inD1的上游正相关调节因子。随后，以GFP作为报告基因研究猪THAP11的亚细胞定位。全长猪THAP11位于细胞核内，并且形成圆点状结构。通过截断突变分析，证实THAP结构域及C端卷曲结构域包含核定位信号，某些截断突变体会募集到核仁内。这种复杂的细胞核内分布，可能对于猪THAP11在细胞核内实现其特定的生物学功能具有关键作用。总之，在此文中，第一次报道了猪THAP11的cDNA序列和亚细胞定位，并为THAP11调节细胞增殖的机制研究提供了一个全新的视野。