论文部分内容阅读
目的：利用Illumina高通量测序技术和生物信息学的方法联合分析库尔勒香梨萼片离区组织的转录组和miRNA，找到与库尔勒香梨萼片脱落和宿存相关的基因和调控通路。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证关联分析得到的miRNA和mRNA在末花期不同时间段脱萼和宿萼两类样品中的表达量，为研究库尔勒香梨萼片脱落的分子机理奠定基础。
方法：盛花前期分别用赤霉素（GA3）和脱萼剂（PP333）喷施库尔勒香梨花。分别在末花期后第1、5、9天采集GA3处理后的第一序位花的离区组织作为宿萼组样品（C_1，C_5，C_9），PP333处理后的第四序位花的离区组织作为脱萼组样品（T_1，T_5，T_9）。构建6种样品的转录组和miRNA文库，利用高通量测序对6个文库进行测序和生物信息学分析，筛选出不同处理样品间显著差异表达的mRNA（DEG）和差异表达的miRNA（DEM）并进行整合分析。用Cytoscape软件绘miRNA-mRNA调控网络图，同时通过GeneOntology（GO）功能富集和KEGGPathway分析关联到的基因的生物学功能。以库尔勒香梨SmallRNA测序中得到的miR156和miR159家族前体序列和成熟体序列为基础进行系统发育进化树的构建、前体和成熟体的序列比对、前体二级结构预测、靶基因预测和表达量分析。研究结果如下：
1、库尔勒香梨离区组织转录组测序分析
将同一时期的萼片宿存组和萼片脱落组进行比较，在C_1vsT_1、C_5vsT_5和C_9vsT_9中分别筛选出2124、1280和1845个DEGs；将萼片宿存组不同时期的样品进行比较，在C_1vsC_5、C_1vsC_9和C_5vsC_9中分别筛选出1835，6366和3991个DEGs；将萼片脱落组中不同时期样品进行比较，在T_1vsT_5、T_1vsT_9和T_5vsT_9中分别筛选到2549、7577和4386个DEGs。
2、库尔勒香梨离区组织SmallRNA测序分析
SmallRNA测序共发现了48种已知miRNA，它们属于24个不同的miRNA家族，同时发现了84个未知的novelmiRNA，并且预测到可能的20744个靶基因。在C_1vsT_1、C_5vsT_5和C_9vsT_9中分别筛选出49、30和49个DEMs；在C_1vsC_5、C_1vsC_9和C_5vsC_9中分别筛选出37、57和43个DEMs；在T_1vsT_5、T_1vsT_9和T_5vsT_9中分别筛选到51、69和62个DEMs。
3、转录组与miRNA的关联分析
在C_1vsT_1中，有45个miRNA和118个mRNA关联到一起；在C_5vsT_5中，有22个miRNA和51个mRNA关联到一起；在C_9vsT_9中，有44个miRNA和136个mRNA关联到一起。通过KEGG分析，我们总结了一些重要的代谢途径可能与萼片脱落有关，包括萜类骨架生物合成、光合作用-天线蛋白、光合作用、卟啉和叶绿素代谢、类胡萝卜素生物合成、玉米素生物合成和植物激素信号转导。此外，我们从可能与萼片脱落相关的miRNA-mRNA对中获得了一些关键基因，包括蛋白磷酸酶2C（psi-miR394a-HAB1）、类受体蛋白激酶（psi-miR396a-5p-HERK1）、纤维素合成酶样蛋白D3（psi-miR827-CSLD3）、β-半乳糖苷酶（psi-miR858b-β-半乳糖苷酶）、SPL-psi-miR156j/157d、脱落酸8-羟化酶1（psi-miR396a-5p-CYP707A1）和生长素响应因子（psi-miR160a-3p-ARF6，psi-miR167d-ARF18，psi-miR167a-5p-ARF25）等。选取8个差异表达的miRNAs和10个差异表达的mRNAs进行qRT-PCR验证，qRT-PCR的结果显示大多数这些mRNA/miRNA与来自mRNA-Seq/miRNA-Seq数据具有相似的表达趋势，并且Pearson相关性也显示大多数miRNA/mRNA表达水平与mRNA-Seq/miRNA-Seq数据有很强的相关性。
4、库尔勒香梨miR159家族成员进化特性及表达分析
库尔勒香梨miR159家族存在2个前体成员（psi-MIR159a、psi-MIR159c）和2个成熟体成员（psi-miR159a、psi-miR159c）。2个前体成员的序列均能形成典型稳定的茎环结构，且序列完全一致，它们的最小折叠自由能（dG）都为-93.95kal?mol-1。系统发育进化树显示，库尔勒香梨和苹果MIR159家族亲缘关系很近。WebLogo分析表明，植物miR159家族成熟体的保守性很高，其保守序列为5’-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUAUU-3’，但库尔勒香梨的碱基保守性较低。靶基因预测显示库尔勒香梨miR159基因家族靶基因为转录因子bHLH91、BES1/BZR1同源蛋白4、热激70ku蛋白质、Trihelix转录因子GT-1、G型凝集素S-受体类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RLK1等。qRT-PCR显示，库尔勒香梨miR159家族的2个成员在初花期、盛花期和末花期3个时期萼片脱落组和宿存组的表达量有显著差异。库尔勒香梨miR159家族在进化过程中既有保守性又有多样性，可能在萼片脱落过程中起作用。
5、库尔勒香梨miR156家族的进化特性及表达分析
库尔勒香梨miR156家族存在11个前体成员（psi-MIR156）和6个成熟体成员（psi-miR156）。11个前体成员的序列均能形成典型稳定的茎环结构，它们的最小折叠自由能（dG）均在-77.20至-7.99kal?mol-1之间。多序列比对显示miR156家族是高度保守的。系统发育树分析表明，psi-miR156家族的遗传关系更接近于苹果和拟南芥。预测psi-miR156家族靶向SPL，半胱氨酸蛋白酶，三螺旋转录因子等。qRT-PCR显示psi-miR156家族的不同成员在萼片离区组织中具有相似的表达趋势，均在末花期的第5天显著增加，表明miR156家族可能在库尔勒香梨的萼片脱落宿存中起作用。
方法：盛花前期分别用赤霉素（GA3）和脱萼剂（PP333）喷施库尔勒香梨花。分别在末花期后第1、5、9天采集GA3处理后的第一序位花的离区组织作为宿萼组样品（C_1，C_5，C_9），PP333处理后的第四序位花的离区组织作为脱萼组样品（T_1，T_5，T_9）。构建6种样品的转录组和miRNA文库，利用高通量测序对6个文库进行测序和生物信息学分析，筛选出不同处理样品间显著差异表达的mRNA（DEG）和差异表达的miRNA（DEM）并进行整合分析。用Cytoscape软件绘miRNA-mRNA调控网络图，同时通过GeneOntology（GO）功能富集和KEGGPathway分析关联到的基因的生物学功能。以库尔勒香梨SmallRNA测序中得到的miR156和miR159家族前体序列和成熟体序列为基础进行系统发育进化树的构建、前体和成熟体的序列比对、前体二级结构预测、靶基因预测和表达量分析。研究结果如下：
1、库尔勒香梨离区组织转录组测序分析
将同一时期的萼片宿存组和萼片脱落组进行比较，在C_1vsT_1、C_5vsT_5和C_9vsT_9中分别筛选出2124、1280和1845个DEGs；将萼片宿存组不同时期的样品进行比较，在C_1vsC_5、C_1vsC_9和C_5vsC_9中分别筛选出1835，6366和3991个DEGs；将萼片脱落组中不同时期样品进行比较，在T_1vsT_5、T_1vsT_9和T_5vsT_9中分别筛选到2549、7577和4386个DEGs。
2、库尔勒香梨离区组织SmallRNA测序分析
SmallRNA测序共发现了48种已知miRNA，它们属于24个不同的miRNA家族，同时发现了84个未知的novelmiRNA，并且预测到可能的20744个靶基因。在C_1vsT_1、C_5vsT_5和C_9vsT_9中分别筛选出49、30和49个DEMs；在C_1vsC_5、C_1vsC_9和C_5vsC_9中分别筛选出37、57和43个DEMs；在T_1vsT_5、T_1vsT_9和T_5vsT_9中分别筛选到51、69和62个DEMs。
3、转录组与miRNA的关联分析
在C_1vsT_1中，有45个miRNA和118个mRNA关联到一起；在C_5vsT_5中，有22个miRNA和51个mRNA关联到一起；在C_9vsT_9中，有44个miRNA和136个mRNA关联到一起。通过KEGG分析，我们总结了一些重要的代谢途径可能与萼片脱落有关，包括萜类骨架生物合成、光合作用-天线蛋白、光合作用、卟啉和叶绿素代谢、类胡萝卜素生物合成、玉米素生物合成和植物激素信号转导。此外，我们从可能与萼片脱落相关的miRNA-mRNA对中获得了一些关键基因，包括蛋白磷酸酶2C（psi-miR394a-HAB1）、类受体蛋白激酶（psi-miR396a-5p-HERK1）、纤维素合成酶样蛋白D3（psi-miR827-CSLD3）、β-半乳糖苷酶（psi-miR858b-β-半乳糖苷酶）、SPL-psi-miR156j/157d、脱落酸8-羟化酶1（psi-miR396a-5p-CYP707A1）和生长素响应因子（psi-miR160a-3p-ARF6，psi-miR167d-ARF18，psi-miR167a-5p-ARF25）等。选取8个差异表达的miRNAs和10个差异表达的mRNAs进行qRT-PCR验证，qRT-PCR的结果显示大多数这些mRNA/miRNA与来自mRNA-Seq/miRNA-Seq数据具有相似的表达趋势，并且Pearson相关性也显示大多数miRNA/mRNA表达水平与mRNA-Seq/miRNA-Seq数据有很强的相关性。
4、库尔勒香梨miR159家族成员进化特性及表达分析
库尔勒香梨miR159家族存在2个前体成员（psi-MIR159a、psi-MIR159c）和2个成熟体成员（psi-miR159a、psi-miR159c）。2个前体成员的序列均能形成典型稳定的茎环结构，且序列完全一致，它们的最小折叠自由能（dG）都为-93.95kal?mol-1。系统发育进化树显示，库尔勒香梨和苹果MIR159家族亲缘关系很近。WebLogo分析表明，植物miR159家族成熟体的保守性很高，其保守序列为5’-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUAUU-3’，但库尔勒香梨的碱基保守性较低。靶基因预测显示库尔勒香梨miR159基因家族靶基因为转录因子bHLH91、BES1/BZR1同源蛋白4、热激70ku蛋白质、Trihelix转录因子GT-1、G型凝集素S-受体类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RLK1等。qRT-PCR显示，库尔勒香梨miR159家族的2个成员在初花期、盛花期和末花期3个时期萼片脱落组和宿存组的表达量有显著差异。库尔勒香梨miR159家族在进化过程中既有保守性又有多样性，可能在萼片脱落过程中起作用。
5、库尔勒香梨miR156家族的进化特性及表达分析
库尔勒香梨miR156家族存在11个前体成员（psi-MIR156）和6个成熟体成员（psi-miR156）。11个前体成员的序列均能形成典型稳定的茎环结构，它们的最小折叠自由能（dG）均在-77.20至-7.99kal?mol-1之间。多序列比对显示miR156家族是高度保守的。系统发育树分析表明，psi-miR156家族的遗传关系更接近于苹果和拟南芥。预测psi-miR156家族靶向SPL，半胱氨酸蛋白酶，三螺旋转录因子等。qRT-PCR显示psi-miR156家族的不同成员在萼片离区组织中具有相似的表达趋势，均在末花期的第5天显著增加，表明miR156家族可能在库尔勒香梨的萼片脱落宿存中起作用。