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目的及意义：
课题组前期研究已证实补肾法具有降低排卵障碍模型大鼠卵巢的氧化产物水平，提高卵母细胞抗氧化能力及卵母细胞质量的作用。实验研究证实重复COS会降低小鼠卵巢抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，使氧化应激产物增加，造成氧化应激状态，进而影响卵母细胞质量。经补肾调经方干预后，可提高SOD及GSH-Px的活性，从而改善小鼠卵巢氧化应激状态，提高卵母细胞质量及抗氧化能力，为卵子受精及胚胎发育创造条件。核因子E2（Nrf2）相关因子，是细胞氧化还原反应的主控调节因子，当细胞受到活性氧（ROS）刺激后，Nrf2被激活发挥其抗氧化损伤作用。除了ROS外，PKC是目前公认在细胞内外均具有Nrf2激动能力的激酶。以氧化应激对卵母细胞的损伤为靶点，通过离体细胞实验，研究补肾调经方（五子衍宗丸合养精种玉汤加减）对小鼠氧化应激卵母细胞抗氧化能力的影响及对PKC/Nrf2抗氧化应激通路的调控作用，以期丰富中医“肾主生殖”的科学内涵，指导临床治疗。
方法：
选用6-7周龄健康雌性SD大鼠30只，灌服补肾调经方2ml/100g体重，高剂量含生药5.4g/ml，低剂量含生药2.7g/ml（高剂量相当于临床用量的20倍，低剂量相当于临床用量的10倍），每日上午7点及下午19点两次灌胃给药，连续4天。于末次灌胃给药1h后，双侧股动脉采血。于室温静置2h，离心3000rpm,10min，取上清，56℃水浴30min灭活补体，0.22μm无菌滤器过滤除菌，得补肾调经方含药血清，-80℃保存备用。选用D24-26健康雌性昆明小鼠120只，体重约22-28g，随机分为6组：正常组、模型组、补肾高剂量组（H2O2+补肾调经方高剂量含药血清）、补肾低剂量组（H2O2+补肾调经方低剂量含药血清）、抗氧化剂NAC组、PKC阻滞剂组（H2O2+补肾调经方+PKC阻滞剂），每组15只。每只小鼠注射PMSG(10IU)超促排卵48h后，颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精消毒，剖开腹部分离出完整的卵巢，清洗并去除卵巢周围的多余组织，用1ml注射器针尖在体式显微镜下挑破卵巢上较大的有腔卵泡，释放出GV期卵母细胞。选择大小均一的GV期卵母细胞，于M2操作液中清洗2-3次，放置35mm培养皿中培养6h及14h，离心收集MⅡ期卵母细胞待检测。使用倒置显微镜观察卵母细胞第一极体排出率；化学法检测抗氧化酶SOD的活性；RT-PCR检测卵母细胞抗氧化酶GSH-Px、SOD的mRNA表达及PKC/Nrf2信号通路中PKC、Keap1、Nrf2的mRNA表达；
结果：
1.倒置显微镜观察发现：与正常组比较，模型组、补肾组及抗氧化剂NAC组第一极体排出率均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，补肾调经方高剂量组及抗氧化剂NAC组第一极体排出率均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；
2.通过化学法检测发现：与正常组比较，模型组、补肾低剂量组抗氧化酶SOD活性下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；补肾高剂量组及抗氧化剂NAC组抗氧化酶SOD活性，与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，补肾高剂量组、抗氧化剂NAC组及正常组抗氧化酶SOD活性显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；
3.RT-PCR检测发现：与正常组比较，模型组、补肾组及抗氧化剂NAC组抗氧化酶SOD、GSH-pxmRNA表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，补肾组及抗氧化剂NAC组抗氧化酶SOD、GSH-pxmRNA表达均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；补肾高剂量组优于补肾低剂量组（P＜0.05）。
4.RT-PCR检测发现：①PKCmRNA表达:与正常组比较，模型组、补肾组、抗氧化剂NAC组及PKC抑制剂组，PKCmRNA表达均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，补肾组、抗氧化剂NAC组PKCmRNA表达均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；PKC抑制剂组与模型组比较，差异无统计意义(P＞0.05)。②KeaplmRNA表达:各组之间比较，Keap1表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。③Nrf2mRNA表达:与正常组比较，模型组、补肾组、抗氧化剂NAC组及PKC抑制剂组Nrf2mRNA表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，补肾组、抗氧化剂NAC组Nrf2mRNA表达均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；PKC抑制剂组与模型组比较，差异无统计意义(P＞0.05)。补肾高剂量组PKC、Nrf2mRNA表达均高于补肾低剂量组(P＜0.05)。
结论：
1.补肾法可提高体外培养氧化应激小鼠卵母细胞第一极体排出率，提示补肾法具有提高卵母细胞成熟率，改善卵母细胞氧化应激状态的作用。
2.氧化应激小鼠卵母细胞抗氧化酶活性降低，补肾调经方可提高抗氧化酶SOD的活性。提示补肾法具有提高卵母细胞抗氧化能力的作用。
3.氧化应激小鼠卵母细胞抗氧化酶表达降低，补肾调经方可提高抗氧化酶SOD及GSH-pxmRNA的表达水平，且补肾高剂量组优于低剂量组。提示补肾法具有提高卵母细胞抗氧化能力的作用，且呈剂量依赖性。
4.补肾调经方可上调PKC/Nrf2信号通路中PKC及Nrf2的表达，补肾高剂量组优于低剂量组。提示补肾法具有调控Nrf2信号通路发挥内源性抗氧化应激作用，且呈剂量依赖性。
课题组前期研究已证实补肾法具有降低排卵障碍模型大鼠卵巢的氧化产物水平，提高卵母细胞抗氧化能力及卵母细胞质量的作用。实验研究证实重复COS会降低小鼠卵巢抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，使氧化应激产物增加，造成氧化应激状态，进而影响卵母细胞质量。经补肾调经方干预后，可提高SOD及GSH-Px的活性，从而改善小鼠卵巢氧化应激状态，提高卵母细胞质量及抗氧化能力，为卵子受精及胚胎发育创造条件。核因子E2（Nrf2）相关因子，是细胞氧化还原反应的主控调节因子，当细胞受到活性氧（ROS）刺激后，Nrf2被激活发挥其抗氧化损伤作用。除了ROS外，PKC是目前公认在细胞内外均具有Nrf2激动能力的激酶。以氧化应激对卵母细胞的损伤为靶点，通过离体细胞实验，研究补肾调经方（五子衍宗丸合养精种玉汤加减）对小鼠氧化应激卵母细胞抗氧化能力的影响及对PKC/Nrf2抗氧化应激通路的调控作用，以期丰富中医“肾主生殖”的科学内涵，指导临床治疗。
方法：
选用6-7周龄健康雌性SD大鼠30只，灌服补肾调经方2ml/100g体重，高剂量含生药5.4g/ml，低剂量含生药2.7g/ml（高剂量相当于临床用量的20倍，低剂量相当于临床用量的10倍），每日上午7点及下午19点两次灌胃给药，连续4天。于末次灌胃给药1h后，双侧股动脉采血。于室温静置2h，离心3000rpm,10min，取上清，56℃水浴30min灭活补体，0.22μm无菌滤器过滤除菌，得补肾调经方含药血清，-80℃保存备用。选用D24-26健康雌性昆明小鼠120只，体重约22-28g，随机分为6组：正常组、模型组、补肾高剂量组（H2O2+补肾调经方高剂量含药血清）、补肾低剂量组（H2O2+补肾调经方低剂量含药血清）、抗氧化剂NAC组、PKC阻滞剂组（H2O2+补肾调经方+PKC阻滞剂），每组15只。每只小鼠注射PMSG(10IU)超促排卵48h后，颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精消毒，剖开腹部分离出完整的卵巢，清洗并去除卵巢周围的多余组织，用1ml注射器针尖在体式显微镜下挑破卵巢上较大的有腔卵泡，释放出GV期卵母细胞。选择大小均一的GV期卵母细胞，于M2操作液中清洗2-3次，放置35mm培养皿中培养6h及14h，离心收集MⅡ期卵母细胞待检测。使用倒置显微镜观察卵母细胞第一极体排出率；化学法检测抗氧化酶SOD的活性；RT-PCR检测卵母细胞抗氧化酶GSH-Px、SOD的mRNA表达及PKC/Nrf2信号通路中PKC、Keap1、Nrf2的mRNA表达；
结果：
1.倒置显微镜观察发现：与正常组比较，模型组、补肾组及抗氧化剂NAC组第一极体排出率均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，补肾调经方高剂量组及抗氧化剂NAC组第一极体排出率均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；
2.通过化学法检测发现：与正常组比较，模型组、补肾低剂量组抗氧化酶SOD活性下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；补肾高剂量组及抗氧化剂NAC组抗氧化酶SOD活性，与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，补肾高剂量组、抗氧化剂NAC组及正常组抗氧化酶SOD活性显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；
3.RT-PCR检测发现：与正常组比较，模型组、补肾组及抗氧化剂NAC组抗氧化酶SOD、GSH-pxmRNA表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，补肾组及抗氧化剂NAC组抗氧化酶SOD、GSH-pxmRNA表达均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；补肾高剂量组优于补肾低剂量组（P＜0.05）。
4.RT-PCR检测发现：①PKCmRNA表达:与正常组比较，模型组、补肾组、抗氧化剂NAC组及PKC抑制剂组，PKCmRNA表达均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，补肾组、抗氧化剂NAC组PKCmRNA表达均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；PKC抑制剂组与模型组比较，差异无统计意义(P＞0.05)。②KeaplmRNA表达:各组之间比较，Keap1表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。③Nrf2mRNA表达:与正常组比较，模型组、补肾组、抗氧化剂NAC组及PKC抑制剂组Nrf2mRNA表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，补肾组、抗氧化剂NAC组Nrf2mRNA表达均升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；PKC抑制剂组与模型组比较，差异无统计意义(P＞0.05)。补肾高剂量组PKC、Nrf2mRNA表达均高于补肾低剂量组(P＜0.05)。
结论：
1.补肾法可提高体外培养氧化应激小鼠卵母细胞第一极体排出率，提示补肾法具有提高卵母细胞成熟率，改善卵母细胞氧化应激状态的作用。
2.氧化应激小鼠卵母细胞抗氧化酶活性降低，补肾调经方可提高抗氧化酶SOD的活性。提示补肾法具有提高卵母细胞抗氧化能力的作用。
3.氧化应激小鼠卵母细胞抗氧化酶表达降低，补肾调经方可提高抗氧化酶SOD及GSH-pxmRNA的表达水平，且补肾高剂量组优于低剂量组。提示补肾法具有提高卵母细胞抗氧化能力的作用，且呈剂量依赖性。
4.补肾调经方可上调PKC/Nrf2信号通路中PKC及Nrf2的表达，补肾高剂量组优于低剂量组。提示补肾法具有调控Nrf2信号通路发挥内源性抗氧化应激作用，且呈剂量依赖性。