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背景：
(1)近年来，治疗性抗体的研究已成为生物工程药物研发的热点，国外已有近20余种抗体药物批准上市。由于人源性抗体对人体免疫原性低，更适于人体内应用，目前抗体药物的研制逐渐发展到以人源抗体为主。大容量抗体库是制备人源抗体的重要技术平台，一个容量足够大且具有良好多样性的抗体库，可获得任何特异性的人源单抗。但由于受大肠杆菌转化率低等因素的影响，大容量抗体库的制备长期以来一直是个难题。
(2)抗体分子大小与抗原结合价数直接影响抗体的穿透性、清除率及其在血清和靶部位的比例。双链抗体(diabody)是一种具有两个抗原结合部位的小分子抗体。在临床应用中，Diabody显示了比完整IgG、Fab和单链抗体(scFv)更好的肿瘤靶向性、瘤组织穿透力和血液清除率，有可能成为最具临床应用潜力的抗体。
(3)杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)是存在人和哺乳动物嗜中性粒细胞中的一种阳离子抗菌蛋白。近年本课题组一直从事BPIN端功能性片段(BPI<,23>)和BPI<,23>-Fc γ 1融合蛋白的研究。鉴于目前没有市售针对BPI N端的特异性抗体，无法用来检测鉴定BPI N端功能片段，给研究工作带来一定的困难。为此，本研究将生物信息学对抗原表位肽的预测原理与抗体库筛选技术相结合，以人工合成的BPI N端抗原表位肽从大容量抗体库中筛选获得针对BPI N端抗原表位的特异性抗体。
目的：
(1)对噬菌体抗体库载体PDF进行改造，在不影响同源重组和载体表达功能的前提下，使其能够更加方便快捷地构建diabody。
(2)构建大容量噬菌体抗体库，探索一种省时、省力、高效的制备大容量抗体库的方法，并将构建大容量噬菌体抗体库与制备diabody统一起来，建立人源抗体的制备技术平台，筛选出具临床应用价值的完全人源性抗体。
(3)通过生物信息学模拟合成BPI N端优势抗原表位肽，对大容量噬菌体抗体库进行筛选以获得人源性抗体，并分析其基因多样性。
方法：
(1)通过设计VL和VH的延伸引物，经重叠PCR(over-lapPCR)扩增得到scFv，将loxp511置于VL和VH之间，同时在loxp511两侧引入内切酶ACCⅢ的识别序列。将scFv克隆入载体PDF，得到表达载体pDscFv。鉴定载体pDscFv的表达功能及制备diabody的可行性。
(2)采用loxp-cre介导的细胞内重组法构建大容量噬菌体抗体库，首先从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA，经：RT-PCR扩增轻、重链可变区基因(VL和VH)，通过over-lap PCR将VL和VH拼接成scFv基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因)，然后将其克隆入噬菌体表达载体pDscFv，获得初级噬菌体抗体库。将初级抗体库以高感染倍数(MOI)超感染cre+菌株BS1365，通过loxp-cre定位重组系统，介导轻、重链在菌内重组配对，再低感染XLI-Blue菌使基因型和表型得以统一，得到大容量抗体库。选用几种抗原对抗体库进行筛选，评价抗体库的质量。
(3)利用生物信息学分析BPI N端(1-199)氨基酸序列的抗原性、亲水性、可塑性、表面可及性和二级结构等理化特性，据此设计并合成BPI N端优势抗原表位肽，经BPI特异性抗体鉴定后，将其包被在抗原管上，通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从大容量噬菌体抗体库中筛选BPI N端特异性抗体；采用间接ELISA法鉴定所获抗体能否与相应抗原表位特异性结合。
结果：
(1)成功构建了噬菌体抗体库表达载体pDscFv，并证实该载体可表达功能性scFv，且能够经酶切直接构建diabody表达载体，建立了一种方便快捷地制备diabody的方法。
(2)通过loxp-cre定位重组系统，得到库容为1.2×10<10>的大容量人源噬菌体抗体库。用4种抗原筛选均获得特异性抗体，表明以载体pDscFv构建的大容量噬菌体抗体库有很好的多样性；在上述工作基础上，将抗地高辛scFv成功构建了地高辛特异性diabody，使其更具临床应用价值，为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体。
(3)预测并人工合成了BPI N端TA、IK两个B细胞表位肽；经BPI特异性抗体鉴定后，分别以TA/IK抗原表位肽为饵，经过4轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”筛选，获得8/6个可与BPI N端特异性结合的克隆，指纹图谱显示TA抗体可变区基因相同，IK抗体则有3种不同的可变区基因片段，基因序列分析表明分别属于不同的抗体亚群。
结论：
(1)构建了噬菌体抗体表达载体pDscFv，可用于构建大容量噬菌体抗体库及制备diabody。
(2)成功构建了大容量噬菌体抗体库，经鉴定具有很好的多样性，可作为获得各种人源抗体的技术平台。
(3)应用生物信息学方法，模拟合成BPI N端优势抗原表位肽TA和IK，并利用大容量噬菌体抗体库获得抗BPI N端的单链抗体，为今后的研究和应用奠定基础。