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猪瘟病毒(Classical swine fever vires,CSFV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组大小约12.3 kb,只含有一个开放阅读框,编码一个由3899个氨基酸组成的多聚蛋白,该蛋白在病毒蛋白酶和宿主细胞酶的作用下,分解成为4个结构蛋白和8个非结构蛋白。猪是CSFV的惟一宿主,CSFV引起的猪瘟是一种高度接触性传染病,具有很高的发病率和死亡率,给养猪业造成巨大的经济损失,世界动物组织将其列为A类传染病之一。
随着猪瘟疫苗的广泛使用,猪瘟由大流行转变为地方性流行或散发,临床症状从典型转变为非典型,出现母猪繁殖障碍和新生仔猪先天性感染。CSFV在疫苗免疫的压力下,逃避宿主免疫系统的识别并建立持续性感染等致病机制目前尚不清楚,对CSFV与宿主相互作用的研究将为阐明这些机制提供线索。猪瘟的病程发展分为潜伏期、前驱期、明显期和转归期四个阶段,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作为宿主免疫系统的重要组成部分同时又是CSFV感染的靶细胞,其基因表达的变化对于猪瘟病程的四个发展阶段极为重要,PBMC基因在这四个发展阶段的动态和整体的转录研究将有助于阐明CSFV与宿主的相互作用机制。
基因芯片可以同时对上万个基因的转录进行研究,获得的病毒诱导宿主细胞基因转录改变的大量信息对研究病毒与宿主的相互作用具有重要的意义。本研究应用猪基因组芯片对CSFV感染潜伏期、前驱期、明显期和转归期四个不同感染阶段的PBMC基因转录进行检测,对转录差异基因的生物学功能分析将增进我们对CSFV与宿主相互作用机制的了解。
3头健康猪每头分别肌肉注射1×106TCID50的CSFV强毒石门株。实验猪攻毒后,出现高热稽留、全身广泛性小点出血、后肢麻痹等典型的猪瘟临床症状,1头猪在感染后第10天死亡,另2头在感染后第12天死亡。在病毒感染前实验猪的淋巴细胞和单核细胞数量分别为6.50±0.26x106个/mL和5.97±1.03×105个/mL,在感染后第9天淋巴细胞和单核细胞数量分别减少至2.03±0.45×106个/mL和0.27±0.46×105个/mL。在CSFV感染后第3天从血液检测到CSFV核酸和蛋白,在CSFV感染后第6天从PBMC中检测到CSFV核酸和蛋白,并且CSFV的核酸拷贝数和病毒滴度随着病程的延长而增多。2头注射磷酸盐缓冲液的阴性对照猪在试验期间均未出现任何猪瘟临床症状,淋巴细胞和单核细胞数量正常,从血液和PBMC中也未检测到CSFV核酸和蛋白。
在感染前第4天和感染后第1,3,6,9天分离猪的PBMC,抽提总RNA,经反转录和体外转录得到的cRNA与基因芯片杂交,筛选转录发生改变的基因。芯片分析显示在病毒感染的整个阶段,3头CSFV感染猪每头分别有2075、2853和2097个基因的转录发生改变。在3头猪中都出现转录改变的基因有485个;在2头猪中都出现转录改变的基因有688个。利用基因芯片显著性分析软件对3头感染猪的基因芯片数据进行综合统计分析,发现有847个基因(占基因芯片上基因总数的4.19％)的转录在CSFV感染后发生2倍以上的显著改变。847个转录发生改变的基因中,分别有541和306个基因的转录发生上调和下调。在感染后第1,3,6,9天的基因转录上调的数量分别是54、181、438和354个;基因转录下调的数量分别是61、120、218和145个。基因的生物学功能分析显示,380个基因的生物学功能未知;余下的467个基因分别参与免疫应答(14.5％,123/847)、细胞凋亡(3.3％,28/847)、信号转导(7.6％,64/847)、转录调控(4.4％,37/847)、新陈代谢(11％,93/847)、转运(3.9％,33/847)、发育(6.8％,58/847)和细胞周期(3.7％,31/847)。
为了检测病原微生物对Ⅰ型干扰素产生途径的影响,本研究同时建立了检测猪细胞因子IFN-α1、IFN-β、IRF-3、IRF-7、TBK1、CREB1和C-Jun基因转录的荧光定量RT-PCR方法,该方法标准曲线的相关系数在0.998～1.000之间,具有良好的线性关系;熔解曲线为特异性单峰,最小检测浓度在30～490 copies/μL。将此方法用于验证基因芯片数据,检测结果与芯片技术分析数据基本一致,证实了基因芯片数据的可靠性。
本研究获得的PBMC转录谱反映了CSFV在猪瘟潜伏期、前驱期、明显期和转归期四个阶段对宿主的影响,这些数据有助于我们从宿主的角度探讨CSFV致病的分子机制,为转录差异基因的深入研究打下良好的基础。