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蜜蜂体内的Apidaecin和Melittin是两种抗菌活性特强,而且抗菌谱广,作用机制各异的优秀抗菌多肽。嵌合多肽是将两个具有各自生物功能的多肽或蛋白分子由中间的连接子(linker)连接形成的一种杂合多肽。
为了提高多肽抗菌物质的基因表达稳定性和表达量,拓宽抗菌谱,以及能够使Apidaecin和Melittin的抗菌谱得到互补,本研究从Genbank上检索得到蜜蜂的Apidaecin序列,再采用本室先前研究的一种突变型蜂毒溶血肽序列,利用一段柔性连接子连接,设计形成一种嵌合多肽分子。并将这种嵌合多肽设计在酵母细胞内进行异源分泌型表达。为蜜蜂多肽这类嵌合毒蛋白的真核表达提供了实验依据和应用的可能性。
目前应用最广泛的linker序列是由重复的4个甘氨酸和1个丝氨酸(GGGGS)n构成的氨基酸序列。因为甘氨酸是分子小且侧链最短的氨基酸,可使其肽链保留两端的柔韧性;而丝氨酸是亲水性最强的氨基酸之一,能够增加所表达蛋白质的亲水性。本研究采用(Gly4Ser)2构成的柔性序列作为连接两个多肽的linker。构建的嵌合多肽用相关软件进行三维结构建模预测,分析连接肽能否确保嵌合多肽的两个功能亚基保持各自能量最低的天然空间构象,以及多肽能否在保持原有生物学功能的基础上增强其活性。
对所推绎设计的蜜蜂嵌合多肽,按照在酵母细胞中进行基因表达的遗传密码偏爱性,设计相关引物,利用PCR技术扩增出嵌合多肽的全基因序列,将其在巴斯德毕赤酵母中进行分泌表达。获得了以下结果:
1.研究设计将Apidaecin和Melittin两个具有各自生物功能的多肽分子用一段(Gly4Ser)2 linker连接成为嵌合多肽的基因。
2.所设计的嵌合分子经SYBYL8.0 Structural Biology&Bioinformatics模块中的FUGUE程序建模预测,通过http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/网站,对嵌合多肽分子的表面的三维结构、亲水性质等进行了在线预测,其结果为进一步做该基因的表达打下基础。
3.本研究在酵母细胞中分泌表达了嵌合基因AM-I,经蛋白质含量测定与计算,表达量为58.3μg/mL。作为一种在酵母细胞中表达蜜蜂多肽嵌合基因的尝试,为今后进一步深入研究异源嵌合基因表达方面提供了一定参考。
4.嵌合基因AM-I的表达产物的抑菌活性有较大幅度的提高,对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌活性均超过了重组蜂毒肽,同时在一定程度上弥补了Apidaecin本身对G+抑制能力低的缺陷,加强了抑菌功能的互补性。
5.根据结构预测与实际所得数据的分析认为,尽管它们各自的抑菌机制有所不同,但两种多肽仍然能够嵌合在一起发挥作用,在抑菌谱和作用机理方面都有所互补。