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目的：乳腺癌目前是女性发病率最高、危害最严重的恶性肿瘤，每年全球大约有120万人被诊断为乳腺癌，约50万人死于乳腺癌，其乳腺癌的复发转移一直是导致病人死亡的主要原因。因此，研究乳腺癌转移的机制是目前乳腺癌研究领域中的重要课题。 丝甘蛋白聚糖(Serglycin，SRGN)属于小分子蛋白聚糖家族，由 SRGN基因编码的核心蛋白和各种粘多糖（ GAG）组成。主要分布在细胞内，也可以分泌和整合到细胞外基质中。其核心蛋白由位于染色体10q22.1 SRGN基因编码，长158个氨基酸，分三个区域组成：信号肽、N端和C端，N端有两个半胱氨酸残基，C端有多个丝氨酸/甘氨酸重复区，主要与 GAG结合，其修饰核心蛋白的GAG链的类型和大小，对SRGN的生物学作用起着关键的作用。SRGN主要在人体正常血液系统各种细胞、一些肿瘤细胞、内皮细胞和胚胎干细胞上发现有表达。有文献表明SRGN的表达与一些肿瘤的形成、转移有关，但是S RGN在肿瘤发生发展中的地位和意义以及作用规律远未得以阐述和明确。 最近，本实验室采用低剂量递增结合大剂量间歇诱导方法，建立了一株稳定的乳腺癌多药耐药细胞株（MCF7/5Fu），发现该耐药细胞株在获得耐药表型同时，也表现出EMT及侵袭转移表型。进一步通过耐药细胞和亲本细胞基因表达谱芯片检测并验证发现，与亲本细胞MCF7细胞相比，SRGN在MCF7/5Fu细胞中表达上调20倍，同时伴有TGFβ2、Vimentin、CD44因子表达明显上调及E-cadherin的下调，提示SRGN及上述相关因子可能介导了MCF7/5Fu的耐药和转移。 在前期工作中，本课题组已证实 SRGN参与乳腺癌多药耐药的作用机制。本项目拟在前期基础上对 SRGN在乳腺癌转移中的作用和机制进行研究，为识别和鉴定乳腺癌新的标志物，阐述乳腺癌发生发展机制提供新的理论依据。 方法： 1.RT-PCR、Western blot方法分别检测不同分子分型乳腺癌细胞系SRGN的表达水平，ELISA方法检测多组乳腺癌细胞培养上清中SRGN的含量。 2.构建针对SRGN的干扰载体，包装为重组慢病毒，感染S RGN表达较高的MDA-MB-231细胞，通过G418筛选出稳定细胞株MDA-MB-231-sh-SRGN及对照组细胞MDA-MB-231-control。同样构建过表达SRGN的过表达载体，感染SRGN表达较低的MCF7细胞，通过G418筛选，最后得到稳定过表达SRGN的细胞 MCF7-SRGN-LV及对照组细胞 MCF7-control，通过划痕实验和 Transwell实验检测SRGN对乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响，并通过Western blot检测SRGN、TGFβ2、EMT相关分子Vimentin、E-cadherin以及转移相关分子MMP2、MMP9的表达。 3.采用不同浓度细胞因子TGFβ2处理体外培养的各乳腺癌细胞后RT-PCR、Western blot、ELISA检测细胞中SRGN表达和含量变化；同时用不同浓度的TGFβ因子抑制剂SD208处理三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231检测SRGN表达量的变化。 4.构建含SRGN启动子的荧光素酶报告基因导入MDA-MB-231细胞，检测不同浓度的TGFβ2及TGFβ抑制因子SD-208处理对SRGN启动子活性的影响。 5.通过生物信息学分析Smad3与SRGN启动区转录因子可能结合位点。 6.将Smad3表达载体与含S RGN启动子荧光素酶报告基因共转染293T细胞，检测Smad3对S RGN转录的调节活性；同时根据5个可能结合位点设计5组PCR引物，利用CHIP实验进一步验证S mad3与S RGN启动子的结合区域。 7.免疫共沉淀实验检测在MDA-MB-231细胞中S RGN与TGFβ2的相互结合情况，ELISA检测SRGN敲低表达MDA-MB-231细胞上清中TGFβ2的含量。 8.将敲低SRGN表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231-sh-SRGN和过表达SRGN的细胞MCF7-SRGN-LV及其对照细胞分别经皮下接种裸鼠体内，建立裸鼠移植瘤模型，观察 SRGN对裸鼠成瘤的影响，待肿瘤形成后，观察并测量体重、长径、短径，同时计算肿瘤体积绘制增长曲线图，同时将上述的细胞分别经裸鼠尾静脉注射后解剖观察肺转移状况以探讨SRGN对乳腺癌体内转移的影响。 9.免疫组化检测66例乳腺癌癌组织及12例对照组织中 SRGN、TGFβ2、MMP2、MMP9的表达，通过病例资料分析S RGN表达与乳腺癌的发生和转移、分子分型的相关性及SRGN表达与TGFβ2、MMP2、MMP9的相关性。 10.通ELISA检测163例乳腺癌患者及38例正常人血清中SRGN的表达水平，通过病例资料分析SRGN表达与乳腺癌的发生和转移、分子分型的相关性。 结果： 1.SRGN在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549中的表达明显高于其它分子分型细胞如MCF7、T47D、BT474、SKBR3、MDA-MB-453等乳腺癌细胞。 2.SRGN敲低表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231-sh-SRGN体外迁移和侵袭能力明显低于对照组细胞 MDA-MB-231-control（P=0.01），且 TGFβ2、MMP2、MMP9、Vimentin下调，而E-cadherin上调；过表达SRGN的MCF7-SRGN-LV细胞的体外迁移和侵袭能力高于对照组细胞MCF7-contro l（P=0.015），且TGFβ2、MMP2、MMP9、Vimentin上调，而E-cadherin下调。 3.TGFβ2明显促进 MDA-MB-231、BT549细胞即 TNBC型乳腺癌细胞中SRGN表达；TGFβ受体抑制剂SD208可明显抑制这一表达。 4.TGFβ2可以显著增强S RGN启动子的活性而上调S RGN的表达；而TGFβ2受体抑制剂SD-208可阻断这一作用。 5.通过进一步分析SRGN启动区转录因子结合位点（-2000--+200），发现有5个Smad2/3结合位点（SBE：AGAC或者互补的GTCT序列），包括-1686至-1682 bp、-1519至-1515 bp、-1329至-1325 bp、-745至-741 bp、+135至+139 bp等五个结合位点，并根据这五个结合位点设计五个 CHIP实验的引物 Smad3-1、Smad3-2、Smad3-3、Smad3-4、Smad3-5。 6.293T细胞中荧光素酶活性检测显示S mad3可增强S RGN启动子的活性，结合CHIP实验显示Smad3可通过SRGN启动子上的结合位点S mad3-1、S mad3-4、Smad3-5调控SRGN的转录。 7.免疫共沉淀实验显示SRGN可与TGFβ2结合，当SRGN表达被敲低后细胞上清中的TGFβ2含量随之降低。 8.从绘制的肿瘤生长曲线图和肿瘤的重量图中，我们可以看出体外SRGN敲低的MDA-MB-231细胞的成瘤能力和转移能力均下降（P<0.05）。 9.SRGN与TGFβ2在乳腺癌组织中的表达高于远端癌旁组织，S RGN在乳腺癌组织中表达与乳腺癌的分子分型、转移有关（P<0.05），而与年龄、肿瘤的大小无关（P>0.05）。TGFβ2在乳腺癌组织中表达与乳腺癌的分型有关（P<0.05），而与年龄、转移、肿瘤的大小无关（P>0.05）。且S RGN与TGFβ2、MMP2、MMP9的表达成正相关关系。 10.SRGN在乳腺癌患者血清中表达高于正常人血清中（P<0.05），且与乳腺癌的分子分型、转移有关（P<0.05）。 结论： 1. SRGN可能是乳腺癌发生发展的标志物之一。 2. TGFβ2可通过下游转录因子Smad3，促进SRGN的转录。 3. SRGN在细胞浆中可以直接结合TGFβ2，促进TGFβ2的自分泌。 4. SRGN促进乳腺癌的转移依赖于与TGFβ2的相互作用。