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背景和目的
特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)是以肾小球基底膜上皮细胞下弥漫性免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚为特点。随着目前肾穿刺活检技术及病理检查手段的迅速普及，特发性膜性肾病的检出率日见增加，并且随其病理分期和发病机制的不同，其预后也变化多端。在我国经肾活检明确原发病的终末期肾脏病患者中，IMN所致占原发性肾脏疾病的8.6％。虽有国外文献报道25％-50％患者可以自发缓解，但仍有30％的患者在5-10年内进展至终末期肾病或死于相关并发症。因此，探讨IMN的中医药治疗途经进而揭示一些其可能的发病机制，对于延缓IMN的发展，提高患者生存率，改善其生活质量具有十分重要的意义。本实验通过观察参芪膜肾颗粒对兔抗鼠FxlA抗血清腹腔注射建立大鼠被动型Heymann肾炎(PHN)病变的影响，探讨参芪膜肾颗粒对特发性膜性肾病(IMN)大鼠模型的发病和作用机制，为中医药治疗IMN的推广及成药开发提供实验依据，并为进一步挖掘和探究其治疗途径提供新思路。
方法
雄性SD大鼠60只，随机分为正常组、模型组。正常组大鼠腹腔一次注入正常兔血清；模型组大鼠腹腔一次注入抗Fx1A1.0ml/100g。造模成功后分PHN肾炎模型组、苍术颗粒治疗组、美洛昔康治疗组、参芪膜肾颗粒治疗组，按不同分组给药。观察8周，监测体重变化，留取尿、血及组织标本。检测24h尿蛋白定量、血清肌酐(Scr)；光镜及电镜下观察大鼠肾脏组织形态学变化；酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠尿TXB2、6-keto-PGF1α和C5b-9的排泄量；间接免疫荧光法观察肾组织内兔抗鼠IgG的表达；免疫组织化学染色、Western blot和实时荧光定量PCR检测COX-2及足细胞nephrin的蛋白和mRNA水平的表达。
结果
1.大鼠一般情况观察
正常组大鼠表现机警，皮毛致密、整齐而有光泽，生长、进食及活动情况均无明显异常，无死亡；PHN肾炎模型组大鼠明显精神萎靡，食欲不振，皮毛枯槁无光泽，活动迟缓；治疗组大鼠精神逐渐好转，活动较频繁。各组大鼠各时间点体重差别均无统计意义(P>0.05)。
2.实验室生化检查
PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组相比，各时间点大鼠24h尿蛋白定量显著升高(P<0.01)。与PHN肾炎模型组相比，第4周开始治疗组24h尿蛋白定量显著降低，但参芪膜肾颗粒组的作用显著优于苍术颗粒组和美洛昔康组(P<0.05)；第6周参芪膜肾颗粒组和美洛昔康组的作用显著优于苍术颗粒组(P<0.01；P<0.05)；第8周参芪膜肾颗粒组、美洛昔康组和苍术颗粒组都有明显降低(P<0.01；P<0.05；P<0.01)。
与PHN肾炎模型组相比，8周末各治疗组血白蛋白上升明显，参芪膜肾颗粒组和美洛昔康组的作用显著优于苍术颗粒组(P<0.01；P<0.01)；8周末各治疗组血肌酐变化不明显(P>0.05)。
3.光镜观察
HE染色可见正常对照组大鼠肾小球、肾小管及间质无明显改变，排列分布及形态均正常。PHN肾炎模型组和治疗组大鼠肾小球系膜细胞、系膜基质无明显增多，毛细血管腔开放良好，肾小球毛细血管壁可见不同程度的缎带样改变。
4.透射电镜观察
PHN肾炎模型组大鼠肾小球基底膜上皮下电子致密物的沉积明显，伴有足细胞肿胀，足突融合等现象，有的小球基底膜可见节段性钉状突起形成，肾间质无明显改变。各治疗组大鼠可见肾小球基底膜不同程度的上皮下电子致密物的轻度沉积，足细胞肿胀，足突融合现象有所缓解。
5.免疫组化观察
PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，足细胞nephrin阳性面积减少(P<0.05)；与PHN肾炎模型组比较，参芪膜肾颗粒组和美洛昔康组足细胞nephrin阳性面积明显增加(P<0.05)，苍术颗粒剂组足细胞nephrin阳性面积增加，但无统计学差异(P>0.05)；PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，足细胞内COX-2阳性面积增加(P<0.05)；与PHN肾炎模型组比较，参芪膜肾颗粒组、美洛昔康组和苍术颗粒剂组COX-2阳性面积无明显变化。
6.大鼠肾脏兔抗鼠IgG沉积的免疫荧光
间接免疫荧光法观察PHN肾炎模型组和治疗组各组大鼠肾小球内，均可见大量兔抗鼠IgG沿GBM呈不连续颗粒状沉积，肾小球轮廓清晰。PHN肾炎模型组荧光强度最高，为++～++，治疗组大鼠肾小球GBM抗体沉积明显减少，荧光强度+～++，三组之间无明显差异。正常对照组无抗体沉积，未见荧光。
7.Elisa方法检测第4、8周末大鼠尿TXB2、6-keto-PGF1α和C5b-9的排泄
PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，尿TXB2的排泄量显著增多(P<0.01)；与PHN肾炎模型组比较，参芪膜肾颗粒组、美洛昔康组和苍术颗粒剂组尿TXB2的排泄量明显减少(P<0.01)；与苍术颗粒剂组比较，参芪膜肾颗粒组和美洛昔康组尿TXB2的排泄量减少(P<0.05，P<0.01)；美洛昔康组更明显，但参芪膜肾颗粒组和美洛昔康组比较无统计学差异(P>0.05)。
PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，尿6-keto-PGFla的排泄量显著增多(P<0.01)；与PHN肾炎模型组比较，治疗组尿6-keto-PGF1α的排泄量明显减少(P<0.01)；美洛昔康组与参芪膜肾颗粒组和苍术颗粒剂组比较，尿6-keto-PGF1α的排泄量明显减少(P<0.05，P<0.01)；但参芪膜肾颗粒组和苍术颗粒剂组比较无统计学差异(P>0.05)。
PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，4周末尿C5b-9的排泄量显著增多(P<0.01)；与PHN肾炎模型组比较，治疗组尿C5b-9的排泄量明显减少(P<0.01)；美洛昔康组、参芪膜肾颗粒组和苍术颗粒剂组相比较，尿C5b-9的排泄量无明显差异(P>0.05)；PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，8周末尿C5b-9的排泄量显著增多(P<0.01)；但PHN肾炎模型组和各治疗组比较无统计学差异(P>0.05)。
8.实时荧光定量PCR检测
PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，足细胞nephrin mRNA表达下调(P<0.05)；与PHN肾炎模型组比较，参芪膜肾颗粒组和美洛昔康组足细胞nephrin mRNA表达上调(P<0.05)，苍术颗粒剂组足细胞nephrin mRNA表达稍上调，但无统计学差异(P>0.05)； PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，足细胞内COX-2表达上调(P<0.05)；与PHN肾炎模型组比较，参芪膜肾颗粒组、美洛昔康组和苍术颗粒剂组COX-2表达无明显变化。
9.Western blot检测
PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，足细胞nephrin蛋白表达减少(P<0.05)；与PHN肾炎模型组比较，参芪膜肾颗粒组和美洛昔康组足细胞nephrin蛋白表达增强(P<0.05)，苍术颗粒剂组足细胞nephrin蛋白表达稍增强，但无统计学差异(P>0.05)；PHN肾炎模型组、治疗组与正常对照组比较，足细胞内COX-2蛋白表达增强(P<0.05)；与PHN肾炎模型组比较，参芪膜肾颗粒组、美洛昔康组和苍术颗粒剂组COX-2蛋白表达无明显变化。
结论
1.应用提取大鼠近曲肾小管刷状缘抗原FxlA免疫家兔制备抗体，成功建立PHN肾炎模型，该模型稳定。
2.参芪膜肾颗粒可以减轻PHN肾炎大鼠的尿蛋白排泄量，提高血白蛋白水平，对大鼠血肌酐无影响。
3.参芪膜肾颗粒通过抑制COX-2的活性而不是通过减少COX-2的生成起作用。
4.参芪膜肾颗粒可以减少C5b-9的排泄，减轻免疫反应对足细胞的损伤。
5.参芪膜肾颗粒可以上调肾小球足细胞nephrin mRNA和蛋白的表达，维持足细胞裂隙膜分子复合体结构的稳定，对PHN肾炎大鼠有治疗作用。