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研究背景近年来结肠癌的发病率逐渐上升,因治疗效果有限,临床上转移和复发常见。肿瘤干细胞被视为肿瘤发生、发展、复发和转移的根源,其生长机制和生物学特性的进一步阐明,将为结肠癌的诊断、治疗、预防和病情评估带来新的希望。而如何有效地分离纯化结肠癌干细胞是首要面临的技术难点。目的通过无血清培养法初步富集人结肠癌Caco一2干细胞,并探讨其可行性,以期为Caco一2干细胞的有效分选方法提供一种思路,为结肠癌的研究构建一种新的干细胞模型。方法将人结肠癌Caco一2细胞接种于无血清培养基中以初步富集Caco一2干细胞,观察其生长增殖过程,通过含血清培养基和无血清培养基交替培养诱导其分化,利用5-氟尿嘧啶、奥沙利铂验证其耐药性,行免疫荧光染色检测结肠癌干细胞特异性标记物CD133的表达。结果1.一部分Caco一2细胞在无血清培养基中逐渐增殖形成悬浮的肿瘤干细胞球,而一部分不能耐受无血清环境的细胞则死亡。2.Caco-2肿瘤干细胞球能在无血清培养基中连续传代,传代后球体生长快,数量多,形态规则。3.Caco-2肿瘤干细胞球重悬于含血清培养基后,球体逐渐发生解聚,分化成贴壁生长的单层细胞。4.Caco-2(?)中瘤干细胞球在含血清培养基和无血清培养基中进行交替培养时,能在单层贴壁细胞和肿瘤干细胞球之间发生相应转化。5.将Caco-2肿瘤干细胞球消化成单细胞后,予以无血清培养联合化疗药物干预显示,一部分细胞被杀死,一部分细胞存活下来并重新增殖成球,且相对于单纯采用无血清培养的无药物干预组而言,其Caco-2肿瘤干细胞球生长快,数量多,体积大。6.无药物干预组、5-氟尿嘧啶干预组、奥沙利铂干预组、5-氟尿嘧啶联合奥沙利铂干预组形成的Caco-2(?)中瘤干细胞球的数目分别为：(10.0±1.15)个/孔、(16.1±1.52)个/孔、(17.5±1.43)个/孔、(18.8±1.14)个/孔,无药物干预组的成球数分别低于3个实验组(P<0.01),5-氟尿嘧啶干预组的成球数分别低于奥沙利铂干预组(P<0.05)和5-氟尿嘧啶联合奥沙利铂干预组(P<0.01),奥沙利铂干预组的成球数低于5-氟尿嘧啶联合奥沙利铂干预组(P<0.05)。7.免疫荧光染色显示Caco-2肿瘤干细胞球呈现出橙红色荧光,即为CD133阳性表达,而阴性对照未发现免疫荧光着色。结论1.人结肠癌Caco-2细胞可以在无血清培养基中形成悬浮的肿瘤干细胞球。2.Caco-2肿瘤干细胞球具有自我更新、不断增殖、分化和耐药的能力。3.无血清培养联合化疗药物干预比单纯采用无血清培养有利于Caco-2干细胞的富集,奥沙利铂的富集效率高于5-氟尿嘧啶,二者联用的富集效率高于单药。4.Caco-2肿瘤干细胞球可以表达结肠癌干细胞特异性标记物CD133。5.通过无血清培养法可以初步富集到人结肠癌Caco-2干细胞的样细胞。