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研究背景与目的压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)是指膀胱无自主收缩情况下腹压突然增高导致尿液不自主流出，也称真性压力性尿失禁、张力性尿失禁、应力性尿失禁，其特点是正常状态下无遗尿，而腹压增高时尿液不自主流出。主要表现为咳嗽或剧烈运动后出现尿液自尿道外口不自主漏出[1,2]，为女性常见病，其患病率随年龄增长而增高，严重影响女性生活质量。SUI的关键机制是膀胱颈支撑功能障碍与尿道固有括约肌缺陷(intrinsic sphincter deficiency，ISD)。而ISD主要由尿道周围平滑肌细胞(smoothmuscle cell，SMC)病变或凋亡所致[3]。目前SUI的治疗方法众多，但均不能从本质上恢复尿道括约肌功能。近年来，成体干细胞的移植已成为再生医学的重要手段[4]，为压力性尿失禁的治疗提供了新的策略。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, bMSCs)具有自我更新和多向分化潜能，经诱导后在体外可分化为多种细胞，尤其如SMC。bMSCs取材方便，可直接由骨髓提取，提取后增长速度较快，可自体移植。同时，由于bMSCs具有诱导多向分化性和表观修饰后能表达特定外源目的基因等特性，将其用作种子细胞，用于基因及细胞治疗的前期研究，已成为当下热点。但值得我们关注的是体外诱导bMSCs向SMC分化的数量及功能均难以达到治疗SUI的目的。因而，研究其作用机制成为我们研究的重点和方向。MSCs多向分化能力可能涉及多种不同的机制,主要包括三个方面，转录因子随机抑制或激活、微环境诱导分化及信号转导通路的调控作用。现越来越多的研究者发现信号转导通路在干细胞分化中发挥着重要的作用。目前的研究已经揭示了调控干细胞命运的三大信号: Notch、Wnt和Shha。其中Notch家族是由高度保守的蛋白质组成，是细胞间实现通讯的重要信号分子。该家族具有受体和基因调节转录的功能，可通过细胞间信息的相互传递使胞内蛋白之间作用而实现信号的调控。其配体为膜蛋白，脊椎动物体内存在多个Notch配体,其中与Deltex同源的称为Deltex或Deltex-like。在本研究获国家自然科学基金资助项目(30772309)研究经费资助。哺乳动物体内，Deltex家族包括deltex-1，Deltex-2，Deltex-3，Deltex-4成员。Deltex-1作为Notch信号通路的下游分子，可增强或抑制Notch信号表达[8]，可通过调控Notch通路以调节淋巴前体细胞、调节神经前体细胞的分化等。Deltex-1蛋白在结构上高度保守，包括三个结构域，DomainⅠ，DomainⅡ和DomainⅢ。DomainⅠ是Deltex-1功能的必须部位，与Notch胞内段ANK重复结构结合，以调节Notch信号[9]；DomainⅡ为脯氨酸聚集区，与SH3结合，主要调节蛋白与蛋白或蛋白与脂类间的相互作用；DomainⅢ与Deltex-1的降解有关。研究表明，Notch通路的激活可促进bMSCs向SMC分化[5-6]。Notch信号通路可分为CSL非依赖及CSL依赖两种途径。Arias等[7]在研究Notch基因突变时在果蝇体内发现CSL非依赖途径,后于哺乳动物体外细胞实验中证实。随后的研究发现, Deltex蛋白在介导CSL非依赖的Notch通路中发挥了重要作用，但其作用机制暂不清楚。因此，本研究探讨bMSCs在SMC环境中deltex-1基因促进bMSCs向SMC分化的作用及其机制，为进一步研究采用经deltex-1基因修饰的bMSCs治疗女性压力性尿失禁奠定基础。方法本研究拟首先分离、培养与鉴定SD大鼠bMSCs，随后克隆Deltex-1基因，构建其腺病毒载体pAd/Deltex-1，并以此腺病毒载体感染大鼠bMSCs，观测Deltex-1基因对大鼠bMSCs增殖的影响。随后将经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养，观测经Deltex-1基因修饰的bMSCs在SMC环境中的变化情况，以此探讨Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制，具体如下。一、bMSCs的分离、培养及鉴定采用密度梯度离心法(percoll,1.073g/ml)分离SD大鼠bMSC，特异性免疫抗体标记结合流式细胞仪及进行成骨、成脂诱导对bMSC的纯度与干性予以鉴定。二、Deltex-1基因腺病毒载体的构建及其在大鼠bMSCs中的表达1.腺病毒载体pAd/Deltex-1的构建、病毒包装与病毒滴度测定设计扩增Deltex-1基因引物，以大鼠肝组织总RNA为模板，RT-PCR扩增Deltex-1基因的全长编码序列，构建其克隆载体PTA2/Deltex-1，并予以测序鉴定。以PTA2/Deltex-1为模板，采用KpnI、Xba1酶切位点将Deltex-1基因亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV，经PmeⅠ酶线性化后，与超螺旋骨架载体pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组，形成重组腺病毒质粒pAd/Deltex-1。脂质体Lipofectamine-2000介导经PacⅠ酶线性化的重组腺病毒质粒pAd/Deltex-1的DNA转染健康293细胞进行病毒包装，倒置显微镜观察，是否可见绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达、病理空斑是否形成、细胞是否变圆等变化，证实pAd/Deltex-1腺病毒包装是否成功。pAd/Deltex-1重组腺病毒经293细胞成功包装后，经5轮传代扩增以提高其滴度，之后大量扩增，采用倍比稀释法测定其滴度。2.Deltex-1基因在大鼠bMSCs中的表达检测第三代大鼠bMSCs贴壁生长至60%～80%融合后，予以Deltex-1重组腺病毒感染，以空病毒感染的bMSCs作对照。倒置荧光显微镜观察并拍照。在基因(RT-PCR法)与蛋白(Western blot技术)水平检测Deltex-1在bMSCs中的表达情况。三、Deltex-1基因促进bMSCs向SMC分化的作用及其机制1.Deltex-1基因对bMSCs增殖的影响—增殖曲线绘制将经Deltex-1基因修饰的bMSCs接种至4个96孔板(3000个细胞/150μl/孔)，以经空病毒与Deltex-1基因干扰片段转染的bMSCs作实验对照，Scramble-a(CGTTTGTCCCTCCAGCATCT)作用的bMSCs作无关对照，未作任何处理的bMSCs作正常对照。每组分别于24h、48h、72h取出一96孔板，每孔加换新培养基与CCK-8，相同条件下继续培养4h，振荡30秒混匀，酶标仪测定450nm波长处光密度值，以光密度值为Y轴，时间为X轴绘制增殖曲线，分析Deltex-1基因对bMSCs增殖的影响。2.免疫荧光组化、RT-PCR及Western blot分析Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制将经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养，采用免疫荧光组化染色结合激光共聚焦、RT-PCR及Western blot观测经Deltex-1基因修饰的bMSCs表达SMC特异标志蛋白α-SMA的情况，具体分组：①b MSC正常对照、②b MSC+空病毒、③b MSC+Deltex-1病毒、④b MSC+空病毒+SMC、⑤b MSC+Deltex-1病毒+SMC、⑥bMSC+Deltex-1干扰+SMC、⑦SMC正常对照。以此探讨Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制。结果一、bMSCs的分离、培养及鉴定采用密度梯度离心法分离的SD大鼠初代bMSC，培养24ｈ后，贴壁生长，呈梭形，培养4～7d后,挑取其单克隆,传代扩增单克隆bMSCs,置孵箱中培养7～10d,观察细胞长势良好。特异性免疫抗体标记结合流式细胞仪检测发现，bMSC的CD90、CD44表达阳性，分别为99.57%和85.66%，CD45表达阴性，阳性率为0.35%；成骨诱导后,茜素红染色发现,3周后细胞质中出现似钙沉淀；成脂诱导后,油红染色发现,3周左右,细胞核周可见折光性较强的脂肪小滴出现,继续培养一周,脂肪小滴逐渐增多。二、Deltex-1基因重组腺病毒载体的构建及其在大鼠bMSCs中的表达1.腺病毒载体pAd/Deltex-1的构建、病毒包装与病毒滴度测定测序证实，克隆到Deltex-1基因全长编码序列，成功构建其重组腺病毒载体pAd/Deltex-1。脂质体介导重组pAd/Deltex-1病毒DNA转染健康293细胞进行病毒包装，10d后，倒置显微镜下可见GFP的表达、病理空斑形成、细胞变圆、肿胀、脱壁及细胞核变大等变化，据此pAd/Deltex-1腺病毒包装成功。包装成功的pAd/Deltex-1病毒经5轮传代扩增以提高滴度，之后大量扩增，采用倍比稀释法测定其滴度为：1.23×1010IU/mL。2.Deltex-1基因在大鼠bMSCs中的表达检测从单克隆分离培养的bMSCs，经Deltex-1病毒感染，每3～5d传1代，传至第3代，与未经感染的bMSCs相比，其形态无异常改变。倒置荧光显微镜观察可见GFP的较强表达，对照组则相反。提取此代细胞的总RNA，并以之为模板，采用R-PCR法可检测到Deltex-1基因的较强表达，对照组Deltex-1基因的表达则较弱。Western blot结果显示，感染pAd/Deltex-1病毒的bMSCs检测，在约67kDa处出现较强的Deltex-1蛋白相应染色带，对照组的该条带则较弱。这些结果提示外源基因Deltex-1能在bMSCs中正常编码表达。三、Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制1.Deltex-1基因对bMSCs增殖的影响—增殖曲线绘制第三代bMSCs总的生长趋势是1～3d为潜伏期，3～5d为快速增殖期,6～7d为平台期。CCK-8法结果显示,各组细胞的生长趋势基本与此相符，但经Deltex-1基因修饰的bMSCs的增殖，72h明显慢于其他组(P<0.01)。2.免疫荧光组化、RT-PCR及Western blot分析Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其机制将经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养，采用免疫荧光组化结合激光共聚焦、RT-PCR及Western blot均能检测到经Deltex-1基因修饰的bMSCs较强表达SMC特异标志蛋白α-SMA，正常对照与空病毒感染等组则较弱，经Deltex-1基因干扰片段转染的bMSCs几乎不表达这些标志蛋白。由此提示，Deltex-1基因可促进bMSCs向SMC分化。结论1.本实验成功分离到纯度好，干性优良的bMSCs；2.克隆到Deltex-1基因全长编码序列，成功构建其重组腺病毒载体pAd/Deltex-1，该载体得以病毒包装，并获得滴度为1.23×1010IU/mL的高感染力病毒；3.成功实现了Deltex-1基因在SD大鼠bMSCs中的表达；4.Deltex-1基因修饰的bMSCs，72h的增殖明显受抑制，与对照组相比P<0.01；5.与未修饰的bMSCs相比，经Deltex-1基因修饰的bMSCs与SMC共培养可高表达SMC特异蛋白α-SMA。Deltex-1基因可促进bMSCs向SMC分化。