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动物细胞摄取铜至少有两条途径:第一,以血浆铜蓝蛋白为递质途径,细胞从血浆铜蛋白—铜蓝蛋白摄取铜:第二,游离铜途径,血浆中与白蛋白或组氨酸结合的铜以及游离铜通过自由通道进入细胞。两条通道均是不依靠能量的易化运输,进入细胞内的铜与细胞内铜蛋白结合。到目前为止,还没有通过细胞培养模型进一步的实验讨论铜与线粒体功能的关系,在本论文中,通过开展细胞培养模型,从体外讨论不同剂量的游离铜对肉鸡肝细胞线粒体功能的影响。
在体外细胞培养试验中,选用无水硫酸铜作为实验铜源,应用改良的半原位灌流法从成年科宝商品代肉鸡肝脏中分离肝细胞,参考E.A.Roberts(2004),Jason M.Hansen(2005)和Mirella Vazzana(2009)的对铜离子作用的研究,设立正常对照组,含铜组(10μM,50μM和100μM)以及阳性对照组(含高浓度抗氧化剂)。阳性对照组通过MTT活性测定,计算出半抑制浓度ICSO=50.5μM,即阳性对照组由50.5μM铜离子+500μM抗氧化剂L-Aseorbic acid构成(保护Cu2+不被氧化为Cu1+从而限制铜进入细胞和延缓细胞过氧化损伤)。各浓度组分别于4h～72h选取不同的铜孵育时间取样进行相关实验,并且每个铜孵育时间重复三次各浓度组的相关实验,每次各重复取样两个,即共六个样品重复量。
为了阐明无机铜离子对成年肉鸡原代肝细胞及其线粒体的影响,本实验分为两个部分,具体内容和结果如下:
1、铜对成年肉鸡原代肝细胞活性的影响(1)用不同浓度的铜离子孵育肝细胞,在开始的1h里细胞活性受到轻度影响,随后保持增殖优势,从24h起增殖抑制愈渐明显,而抑制程度各异。铜离子浓度为50μM时,在24h～72h试验点肝细胞的增殖抑制明显(P＜0.05);当铜离子浓度增加为100μM,从4h试验点起肝细胞的增殖就受到明显抑制,细胞活性明显降低(P＜0.05)。
(2)随着离子铜浓度增加和铜孵育时间增加,肝细胞上清液中ALT和AST的活性均有升高趋势。当铜离子浓度为100μM时,上清液中AST,ALT活性与对照组比较升高趋势明显(P＜0.05)。
(3)任一单一铜离子浓度组肝细胞的数量和糖原含量均随培养时间的延长呈显著下降趋势。48h和72h时,原代肝细胞的数量和糖原含量随铜离子浓度增加而显著下降(P＜0.05);4h～72h,100μM铜离子浓度组的原代肝细胞数量和糖原含量下降趋势最显著(P＜0.05)。
二、铜离子对成年肉鸡原代肝细胞线粒体功能的影响(1)铜离子对体外原代培养的肝细胞线粒体呼吸功能有较明显的影响,实验(24h)前期,当肝细胞处于对数增长期时,除100μM铜离子浓度组外,其他组线粒体呼吸功能均呈增强趋势,24h、50μM铜离子浓度组的线粒体发挥最佳功能,在呼吸功能方面有明显的增强表现(P＜0.05);随着肝细胞进入平台期后逐渐进入衰亡期(实验48h～72h),随着铜离子浓度越高,线粒体呼吸功能随之下降得越快。
(2)实验前期(铜孵育48h前),除0μM铜离子浓度组外,其他各浓度组MPTP值随孵育时间增加均呈现上升趋势。实验后期(铜孵育48h后),0μM组和IC组组内MPTP变化差异不显著(P＞0.05),其他各组组内差异显著。组间比较发现,50μM组和100μM组组间MPTP变化差异均显著(P＜0.05)。IC组MPTP变化显著低于50μM组和100μM组(P＜0.05)。可见,随着铜离子浓度升高和铜孵育时间的延长,吸光度下降越明显,对膜通透性影响越大。100μM组在48～60h MPTP均呈现显著增加(P＜0.05),而72h处则显著下降(P＜0.05),达到整个实验组的最低值。
(3)铜离子对线粒体过氧化氢的生成有显著影响,不但可以提高H2O2含量,更是能加快其中H2O2的生成速率。实验前期,铜浓度越高,孵育时间越长,生成速率越大,说明铜可诱导体内的氧化反应,或降低体内的抗过氧化作用,促使线粒体氧化呼吸链中电子的漏出,在SOD催化下,H2O2生成增多,加快。实验后期随着铜离子孵育时间的延长(72h),H2O2产生逐渐下降。另外实验发现4h和24h处肝细胞线粒体复合体Ⅰ、复合体Ⅲ和复合体Ⅴ产生的电子漏较多,H202生成较多,为铜离子对线粒体膜呼吸链的主要作用位点;48h处铜离子对线粒体膜呼吸链的作用位点主要在复合体Ⅰ、复合体Ⅲ、复合体Ⅳ和复合体Ⅴ,且复合体Ⅳ产生严重电子漏现象,产生大量H202;60h处铜离子对线粒体膜呼吸链的作用位点主要在复合体Ⅲ;72h处铜离子对线粒体膜呼吸链的作用位点主要在复合体Ⅰ、复合体Ⅱ和复合体Ⅲ。可见,复合体Ⅲ可能是线粒体发生电子漏的主要位点。
(4)铜离子对成年肉鸡原代肝细胞复合体Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ活性的影响存在浓度和时间依赖性。铜孵育前期(24h前),低剂量铜离子组上升趋势显著高于高剂量组,高剂量铜离子组呈现缓慢上升趋势。但在铜孵育中后期(24h后),随着时间的增加,线粒体复合物活性呈现下降趋势,且高剂量铜离子浓度组下降程度显著高于低剂量组(P＜0.05),尤其是100μM铜离子浓度组在铜孵育72h降低到整个复合物活性实验的最低值。另外发现,在4h～72h实验周期里复合体Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ的活性变化较复合体Ⅱ显著(P＜0.05)。