Rab27a基因通过调节血小板功能及其微囊泡(PMVs)释放影响缺血性脑卒中的发生发展

• 作 者: 王小霞
• 机 构: 广东医科大学
• 出 处: 广东医科大学
• 发表日期: 2019年4期
• 关键词: 缺血性脑卒中

【目的】：
　　血小板作用于内皮细胞对卒中的发生发展十分重要，是血栓形成过程中的主要参与者。血小板活化释放的微囊泡（PMVs，血小板微粒）可通过转移携带的遗传信息调控内皮细胞的功能。我们前期研究发现，相对于C57小鼠，Rab27a基因敲除小鼠（Rab27a-KO小鼠）全血中PMVs水平降低，但Rab27a-KO小鼠的血小板功能及其释放的PMVs对人脑微血管内皮细胞（HBMECs）功能的影响仍需进一步研究。本研究利用Rab27a-KO小鼠的血小板及其活化产生的PMVs对HBMECs进行干预，研究Rab27a-KO小鼠的血小板粘附功能的变化以及Rab27a-KO小鼠的血小板微囊泡(Rab27a-KO-PMVs)对HBMECs增殖活性、凋亡、迁移能力及其促进血管环生成的影响，探讨Rab27a-KO-PMVs是否通过影响eNOS磷酸化水平影响HBMECs的增殖活性，进而影响缺血性脑卒中的发生发展。
　　【方法】：
　　1.纳米颗粒分析仪（NTA）检测Rab27a-KO小鼠基因敲除前后血小板及PMVs的水平变化。
　　2.结晶紫染色法检测血小板的粘附功能。
　　3.NTA测定PMVs粒径；流式细胞仪检测CD41+PMVs阳性率。
　　4.MTT法测定PMVs对HBMECs增殖活力的影响。Hoechst33258染色法、Annexin5.V/7-AAD双染法检测PMVs对饥饿处理的HBMECs的凋亡情况的影响;划痕试验及血管形成试验检测PMVs对HBMECs迁移和促血管形成功能的影响。
　　5.Westernblot蛋白印记技术检测PMVs对HBMECs增殖相关蛋白eNOS的磷酸化水平的影响。
　　【结果】：
　　1.C57小鼠全血中血小板的数目与Rab27a-KO小鼠没有差异（P＞0.05）。但相比于C57小鼠，Rab27a-KO小鼠全血中PMVs水平降低（P＜0.05）。
　　2.不同小鼠来源的PMVs和血小板及HBMECs共同培养，Rab27a-KO小鼠的血小板粘附能力下降（P＜0.05）。
　　3.PMVs粒径约100nm-400nm；流式细胞仪可见C57小鼠和Rab27a-KO小鼠来源的CD41+PMVs高达90%。
　　4.C57-PMVs组HBMECs增殖活性较PBS组明显上升（P＜0.05），而Rab27a-KO-PMVs组与C57-PMVs组相比,HBMECs增殖活性下降（P＜0.05），但较PBS组增殖活性上升（P＜0.05）。
　　5.经过饥饿处理后,C57-PMVs组的凋亡率较PBS组明显下降（P＜0.05），而Rab27a-KO-PMVs组与C57-PMVs组相比,凋亡率上升（P＜0.05），但较PBS组下降（P＜0.05）。
　　6.经划痕处理后，C57-PMVs组HBMECs迁移能力较PBS组明显增强（P＜0.05），而Rab27a-KO-PMVs组与C57-PMVs组相比,HBMECs迁移能力减弱（P＜0.05），但较PBS组迁移能力增强（P＜0.05）。
　　7.C57-PMVs组HBMECs促血管形成能力较PBS组明显增强（P＜0.05），而Rab27a-KO-PMVs组与C57-PMVs组相比,促血管形成能力减弱（P＜0.05），但较PBS组增强（P＜0.05）。
　　8.经Westernblot检测，C57-PMVs组HBMECs内eNOS的磷酸化水平较PBS组明显增强（P＜0.05），而Rab27a-KO-PMVs组与C57-PMVs组相比,HBMECs内eNOS的磷酸化水平减弱（P＜0.05），但较PBS组增强（P＜0.05）。
　　【结论】：
　　1.Rab27a-KO-Platelets和Rab27a-KO-PMVs降低血小板的粘附功能，可能参与延缓脑血栓形成的发生发展。
　　2.Rab27a-KO-PMVs可抑制HBMECs的增殖、迁移及促血管形成能力，但促进HBMECs的凋亡。
　　3.Rab27a-KO-PMVs通过减少HBMECs内eNOS的磷酸化水平，抑制HBMECs的增殖活性。