论文部分内容阅读
【目的】
用基因工程技术，在大肠埃氏菌及昆虫细胞SF9中表达重组鲎血G因子，为研制早期深部真菌感染检测试剂奠定基础。
【方法】
对鲎G因子基因序列分析后，根据大肠杆菌偏好性进行优化，将G因子α亚基cDNA和β亚基cDNA装载到原核表达载体pET32a-sumo上，分别构建pET32a-sumo/factorG-α和pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒。构建并检测序列正确后，转入感受态E．coliBL21(DE3)中，IPTG进行诱导表达。使用超声破碎菌体，SDS-PAGE测定蛋白质分子量。尿素变性后用透析袋梯度透析复性。然后经Ni-NTA亲和层析，用SUMO蛋白酶切割融合伴侣，纯化后得到重组目的蛋白factorG-α和factorG-β。等摩尔质量重组后得到复合物G。使用荧光底物Boc-Glu-(OBzl)-Gly-Arg-MCA检测复合物的活性。
去除鲎G因子两个亚基本身信号肽编码序列，添加昆虫信号肽编码序列，将两个亚基基因序列优化后，载入到昆虫Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，分别构建pFastBacl/G-α和pFastBacl/G-β1质粒，合成并检测序列正确，转化到E．coliDH10Bac感受态，小量抽取质粒后PCR鉴定。将重组Bacmid转染SF9细胞，进行重组杆状病毒扩增。使用病毒感染SF9细胞，收集培养基上清和细胞裂解物，经WesternBlot检测目的蛋白。表达产物经Ni-NTA亲和层析进行纯化。
【结果】
成功构建pET32a-sumo/factorG-α和pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒，基因测序结果与目的序列一致。在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量约为103kDa和63kDa的目的蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化，用SUMO蛋白酶切割融合伴侣得到大小约为74kDa重组目的蛋白factorG-α和大小约为34kDa重组目的蛋白factorG-β。通过等摩尔融合得到复合物G，使用荧光底物检测复合物具有酶活性。
成功构建pFastBacl/G-α和pFastBacl/G-β1昆虫表达质粒，PCR和酶切鉴定为阳性，基因测序结果与目的序列一致。WesternBlot显示，在SF9细胞培养基中成功表达出相对分子质量约为74kDa的目的蛋白G-α，在SF9细胞中检测到相对分子质量约35kDa的目的蛋白G-β1。经Ni-NTA亲和层析，纯化后得到重组目的蛋白G-α，未能纯化获得目的蛋白G-β1。
【结论】
大肠杆菌表达系统成功表达了鲎血G因子的亚基α和亚基β，为进一步探讨鲎血G因子的生物学功能以及为新型真菌感染检测试剂盒开发奠定基础。
用基因工程技术，在大肠埃氏菌及昆虫细胞SF9中表达重组鲎血G因子，为研制早期深部真菌感染检测试剂奠定基础。
【方法】
对鲎G因子基因序列分析后，根据大肠杆菌偏好性进行优化，将G因子α亚基cDNA和β亚基cDNA装载到原核表达载体pET32a-sumo上，分别构建pET32a-sumo/factorG-α和pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒。构建并检测序列正确后，转入感受态E．coliBL21(DE3)中，IPTG进行诱导表达。使用超声破碎菌体，SDS-PAGE测定蛋白质分子量。尿素变性后用透析袋梯度透析复性。然后经Ni-NTA亲和层析，用SUMO蛋白酶切割融合伴侣，纯化后得到重组目的蛋白factorG-α和factorG-β。等摩尔质量重组后得到复合物G。使用荧光底物Boc-Glu-(OBzl)-Gly-Arg-MCA检测复合物的活性。
去除鲎G因子两个亚基本身信号肽编码序列，添加昆虫信号肽编码序列，将两个亚基基因序列优化后，载入到昆虫Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，分别构建pFastBacl/G-α和pFastBacl/G-β1质粒，合成并检测序列正确，转化到E．coliDH10Bac感受态，小量抽取质粒后PCR鉴定。将重组Bacmid转染SF9细胞，进行重组杆状病毒扩增。使用病毒感染SF9细胞，收集培养基上清和细胞裂解物，经WesternBlot检测目的蛋白。表达产物经Ni-NTA亲和层析进行纯化。
【结果】
成功构建pET32a-sumo/factorG-α和pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒，基因测序结果与目的序列一致。在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量约为103kDa和63kDa的目的蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化，用SUMO蛋白酶切割融合伴侣得到大小约为74kDa重组目的蛋白factorG-α和大小约为34kDa重组目的蛋白factorG-β。通过等摩尔融合得到复合物G，使用荧光底物检测复合物具有酶活性。
成功构建pFastBacl/G-α和pFastBacl/G-β1昆虫表达质粒，PCR和酶切鉴定为阳性，基因测序结果与目的序列一致。WesternBlot显示，在SF9细胞培养基中成功表达出相对分子质量约为74kDa的目的蛋白G-α，在SF9细胞中检测到相对分子质量约35kDa的目的蛋白G-β1。经Ni-NTA亲和层析，纯化后得到重组目的蛋白G-α，未能纯化获得目的蛋白G-β1。
【结论】
大肠杆菌表达系统成功表达了鲎血G因子的亚基α和亚基β，为进一步探讨鲎血G因子的生物学功能以及为新型真菌感染检测试剂盒开发奠定基础。