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细菌性疾病是威胁水产养殖鱼类健康的主要原因之一。长期以来,采用化学制剂和抗生素类药物治疗鱼病,不仅病原菌耐药性增强,还会使鱼体药物残留而对人类造成间接地伤害。鱼类疾病控制正在向用鱼用疫苗放置方向发展。鱼病的疫苗免疫防治技术是最佳的鱼病防治策略,但鱼类的特殊生活环境,注射和口服免疫接种的方式都不是最优途径,浸泡则成为鱼用疫苗的首选。为了增强浸泡疫苗的免疫保护效果,本研究以前期筛选出的皂角苷为佐剂,以甲醛灭活鳗弧菌疫苗,以大菱鲆为实验鱼类,从鱼类非特异性免疫和特异性免疫两个方面,对皂角苷的佐剂功能进行评价,以期从分子水平上阐明皂角苷佐剂的免疫机理。 第一部分,以不同浓度的皂角苷(15mg/L、35 mg/L)为佐剂,用灭活鳗弧菌为浸泡疫苗免疫大菱鲆,采用腹腔注射为阳性对照组,对免疫后不同时间段内各主要免疫器官(皮肤、鳃、头肾、脾脏和肠组织)中各主要免疫相关基因的表达量进行了定量分析。结果表明,在两组皂角苷佐剂联合浸泡疫苗组的大菱鲆的鳃组织中,MHCⅡα基因在浸泡的4~8 h内,即表现出显著的表达,相对表达量分别为136.3和378.5,1d后表达量迅速降低。高浓度的皂角苷组及皂角苷联合疫苗浸泡组在浸泡8 h时的大菱鲆皮肤中,MHCⅡα基因的相对表达量即可出现显著提高,相对表达量47.1和41.9,3~15d内,皮肤中MHCⅡα基因的相对表达量最高的一组出现在低浓度皂角苷(15mg/L)联合疫苗浸泡组,表达量为57.6。浸泡1 d后,脾脏中MHCⅡα基因相对表达最高的组出现在注射对照组中,且该基因的高相对表达量在脾脏持续至15 d。在脾脏中,浸泡3 d~15 d内低浓度皂角苷联合疫苗浸泡组的MHCⅡα基因呈现次高相对表达量,仅次于注射组,显著高于其他各组(P<0.05),在头肾中,浸泡后的第3 d,两组皂角苷联合疫苗浸泡组的MHCⅡα基因呈现高相对表达量,两组表达差异不显著(P>0.05)。而在注射组中,头肾的MHCⅡα基因表达从浸泡后的第3 d开始,到第15 d时呈现最高值,相对表达量分别到达6.37,显著高于其他各组(P<0.05)。对IL-1β基因在皮肤、鳃、头肾、脾脏和肠中的表达分析结果显示,皮肤中IL-1β表达的最高值,出现在佐剂联合疫苗组,其中低浓度组(15mg/L)比高浓度组(35mg/L)的表达高,二者显著高于其他组(P<0.05),相对表达量分别为14.01和11.02。IL-1β与MHCⅡα在皮肤中的表达趋势相同,鳃中IL-1β表达的最高值,同样出现在佐剂联合浸泡疫苗组,分别达到21.58和32.58,且显著高于其他各组(P<0.05)。头肾和脾脏组IL-1β表达的最高值都出现在4 h的注射组,表达量分别是169.53和222.1,显著高于其他各组(P<0.05)。头肾和脾脏两个组织中,佐剂联合疫苗组表达优于其他各组,但差异不显著(P>0.05)。肠中IL-1β的的表达的最高值仍然出现在注射组,表达量为24.51,次高组为高浓度佐剂联合浸泡疫苗组,表达量达到20.02。TNF-α在皮肤中的表达高峰出现在7d的低浓度佐剂加疫苗组,其他各组差异不显著。鳃中的表达量最高出现在7d注射组,同时间佐剂加疫苗组的表达是次高值。佐剂加疫苗组的肠中TNF-α的表达在8 h时出现明显上调,显著高于其他各组,而15 d的注射组才开始上调。脾脏中TNF-α表达只有注射组在7 d时显著升高是其他各组的近百倍。头肾中的最高值出现在单佐剂组,而注射组在整个事件段都显示出明显优势。 对大菱鲆背腹面不同分区的皮肤进行三种基因表达分析表明,MHCⅡα基因表达量最高的出现在鳃盖下方皮肤,达到6.56。其次是尾部侧线达到6.31,腹面抗原呈递效果不明显。IL-1β和TNF-α基因的表达趋势与MHCⅡα的相同。 结果表明,皂角苷联合鳗弧菌疫苗浸泡免疫大菱鲆后,可以显著提高疫苗抗原在皮肤等组织中呈递,同时引发相应组织的炎症反应。 本文第二部分评价了皂角苷增强鱼类非特异免疫效果,分别用浓度为0、15和35 mg/L的皂角苷浸泡大菱鲆,分析了浸泡后6、12、24、48和72 h时大菱鲆白细胞的吞噬活力、血清补体旁路途径溶血活性、血清与黏液中溶菌酶活性、抑菌活性与碱性磷酸酶活性及血清总蛋白浓度。结果显示,皂角苷低浓度组(15 mg/L)与高浓度组(35 mg/L)大菱鲆白细胞吞噬活力分别在浸泡后12 h与24 h出现显著的增高(P<0.05)。实验组大菱鲆血清中补体旁路途径溶血活性除低浓度组在12 h与24 h较对照组低外,其他检测时段均高于对照组(P<0.05)。血清溶菌酶活性最高值出现在低浓度组浸泡后6h时,黏液中未能检测出。不同时间点各组大菱鲆黏液抑菌活力变化幅度较大,两实验组黏液抑菌活力在浸泡后6h与12h时较对照组提高,两个实验组间无差异(P>0.05)。血清中AKP活力高峰值出现在浸泡后6 h与12 h,该时段AKP的活力显著高于对照组,且实验组间存在差异(P<0.05),而黏液中AKP高峰值出现在12 h,该时段AKP的活力显著高于对照组(P<0.05),实验组间无差异。浸泡皂角苷后6 h高浓度组血清中蛋白浓度达到最高值,除12 h时各组差异不显著外(P>0.05),24 h~72 h高浓度组中血清蛋白含量均高于低浓度及对照组(P<0.05)。结果表明皂角苷具有提高鱼类非特异免疫水平的效果,结果为皂角苷的佐剂应用提供了理论的支持。