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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的经济蟹类，广泛分布于中国、日本及朝鲜等海域。随着养殖业的不断发展，梭子蟹病害的发生也越来越频繁，包括细菌病、病毒病、真菌病等，给我国养殖业带来了巨大的经济损失。在这种情况下，蟹类免疫防御机制的研究和抗病品系的选育对蟹的养殖具有重要的潜在意义。本研究在已经构建的三疣梭子蟹眼柄和血细胞cDNA文库的基础上，通过对表达序列标签(EST)进行分析，从中鉴定出2种crustin基因(PtCrustin2和PtCrustin3)。PtCrustin2cDNA全长为1105bp，包含一个297bp的开放阅读框，编码98个氨基酸，分子量为10.97kDa，等电点为5.23。PtCrustin3cDNA全长为629bp，包含一个348bp的开放阅读框，编码115个氨基酸，分子量为12.65kDa，等电点为6.42。在PtCrustin2和PtCrustin3氨基酸的N端都有一段信号肽序列，C端一个WAP结构域，两者之间为一个半胱氨酸-富含结构域。基因组序列分析表明，PtCrustin2和PtCrustin3是由不同的基因位点编码，PtCrustin2基因片段包含三个外显子和两个内含子，而PtCrustin3基因片段含有四个外显子和三个内含子，所有的内含子剪接位点都有典型的GT和AG二核苷酸剪接信号。通过对敏感群体和耐受群体样品的直接测序，在PtCrustin2和PtCrustin3基因组序列中分别发现了3和4个与梭子蟹对溶藻弧菌敏感/抗性相关的SNP位点。这些相关性SNP多数位于内含子内，只有PtCrustin3中的位点87位于外显子中，且为非同义突变。此外，在PtCrustin2的第二个内含子中发现了一个与敏感/抗性相关的微卫星位点。两种crustin亚型在健康梭子蟹不同检测组织中均有表达。与以往发现的crustin不同，PtCrustin2和PtCrustin3分别在眼柄和鳃中的表达量最高，而在血细胞中的表达量很低。在三疣梭子蟹受到溶藻弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母刺激后，PtCrustin2和PtCrustin3基因的时序表达变化有明显的不同，PtCrustin2在受到刺激后表达量明显上升，并在24小时达到最大值；PtCrustin3在受到刺激后表达量迅速上升，在4小时或8小时达到了最大值，这说明在面对微生物刺激时，PtCrustin3比PtCrustin2反应更迅速、敏感。两种重组蛋白的抗菌谱很相似，都对革兰氏阳性菌藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌有一定的抑制作用。此外，重组蛋白PtCrustin2对毕赤酵母也有一定的抑菌效果；PtCrustin3对革兰氏阴性菌溶藻弧菌也有较强的抑制作用。杀菌实验显示重组蛋白PtCrustin2和PtCrustin3都能够在孵育6小时内迅速杀死藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，因此PtCrustin2和PtCrustin3具有杀菌作用。以上研究结果揭示了三疣梭子蟹crustin不同亚型的分子基础、组织分布特点、对微生物响应特点和抗菌性。此外，SNP位点的研究对深入认识三疣梭子蟹的免疫防御机制，指导优良品种选育具有一定的参考价值。