【摘 要】
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[目的]缺血性脑卒中（IS）是以脑神经元凋亡坏死为病理基础的疾病,有效保护神经元是缺血性脑卒中的防治核心。然而,目前尚无针对缺血性脑卒中神经元损伤的有效治疗手段。环型GMP-AMP合成酶（cGAS）作为胞内DNA感受器,在多种疾病中发挥免疫调节作用,但与缺血性脑卒中的关系仍缺乏研究。本研究的目的是首先明确cGAS是否在小胶质细胞内表达,cGAS的水平与缺血性脑卒中的严重程度是否有一定的相关性;其次
【基金项目】
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国家自然科学基金（81860326）；
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[目的]缺血性脑卒中（IS）是以脑神经元凋亡坏死为病理基础的疾病,有效保护神经元是缺血性脑卒中的防治核心。然而,目前尚无针对缺血性脑卒中神经元损伤的有效治疗手段。环型GMP-AMP合成酶（cGAS）作为胞内DNA感受器,在多种疾病中发挥免疫调节作用,但与缺血性脑卒中的关系仍缺乏研究。本研究的目的是首先明确cGAS是否在小胶质细胞内表达,cGAS的水平与缺血性脑卒中的严重程度是否有一定的相关性;其次通过下调cGAS能否缓解急性缺血性脑卒中神经元凋亡坏死,促进小胶质细胞由M1（炎症）向M2（修复）极化表型的转化,减少炎症因子产生,从而减轻炎症损伤,抑制缺血性脑卒中的进展。阐明cGAS在缺血性脑卒中触发炎症反应的具体机制,为缺血性脑卒中防治提供新思路。[方法]1、我们分别采用C57BL/6小鼠和小鼠海马神经元细胞株HT22构建大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）小鼠动物模型和HT22细胞氧葡萄糖剥夺/复苏（oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）细胞模型,在体内外实验中,利用组织免疫荧光法、RT-PCR技术和免疫印迹法验证cGAS-STING信号轴在脑组织和细胞上的表达及分布情况,同时确定最佳的时间点;同时在细胞水平实验中,加入ddC（线粒体DNA特异性抑制剂）,检测ddC对cGAS及下游通路蛋白表达调控作用。2、我们构建cGAS慢病毒载体,将si-cGAS提前一周注射到小鼠右侧脑室体内,再构建MCAO模型,通过TTC染色、神经行为学评分、TUNEL和Nissl等方法分析si-cGAS对缺血性脑卒中后保护作用。3、将si-cGAS慢病毒与BV2小胶质细胞共培养,构建OGD/R模型,分为si-NC 组、si-cGAS 组,通过 ELISA 检测细胞液中 iNOS、TNF-α、TGF-β、IL-10含量,验证si-cGAS能否有抑制炎症因子释放的作用,并用原代小胶质细胞进一步加以验证;同时在细胞水平加入ddC,检测ddC对小胶质细胞分泌的炎症因子调控作用。4、本部分实验利用C57BL/6小鼠建立脑缺血再灌注损伤模型（IRI）后,分为sham组、MCAO+si-NC组、MCAO+si-cGAS组,3d后分别用免疫印迹法和组织免疫荧光法,明确si-cGAS对脑组织中cGAS-STING信号轴的调控关系和与小胶质细胞空间定位关系;同时通过流式细胞分析术（FACS）对小胶质细胞亚群进行分析,观察si-cGAS对小胶质细胞极化的调控作用。在细胞实验部分,通过免疫印迹法和流式细胞分析术观察si-cGAS对下游蛋白调控作用及小胶质细胞极化的变化。[结果]1、在BV2细胞OGD/R模型和小鼠MCAO模型中,通过蛋白免疫印迹法和组织免疫荧光方法,我们发现cGAS-STING信号轴在小胶质细胞内被激活,随着时间延长,信号轴上蛋白表达量而下降;ddC预处理后,cGAS-STING信号轴上蛋白表达量有不同程度的下降。2、在小鼠MCAO模型中,si-cGAS预处理后TTC染色我们发现梗塞区域明显减少;Niss1染色发现si-cGAS预处理后凋亡神经元数目明显减少;对C57BL/6小鼠进行神经功能评分,si-cGAS预处理能明显改善神经功能体征。3、在BV2细胞OGD/R模型中,我们通过ELISA检测发现促炎因子iNOS、TNF-α含量明显升高,si-cGAS预处理后iNOS、TNF-α含量明显降低,而TGF-β、IL-10表达变化不明显;原代小胶质细胞进一步证实了细胞株的结果。4、在细胞和动物水平,我们通过FACS检测发现si-cGAS预处理后CD16/32小胶质细胞亚群明显下降,而CD206/Arg1小胶质细胞亚群明显增多,M1/M2比值明显下降,表明小胶质细胞出现了极化的转变。[结论]1、在脑缺血再灌注损伤中,cGAS-STING信号通路在小胶质细胞内被显著激活。2、si-cGAS预处理可以明显减少脑缺血再灌注损伤后梗死面积,并显著缓解脑缺血再灌注损伤后的神经体征;同时,si-cGAS能减轻脑缺血再灌注损伤后引起的神经元损伤,达到脑保护作用。3、缺血性脑卒中能激活小胶质细胞并分泌大量的促炎因子,促进小胶质细胞向M1型转变。si-cGAS预处理后可以减少促炎因子过量表达,促使小胶质细胞向M2型转变,发挥对脑缺血再灌注损伤后的保护效应。
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