论文部分内容阅读
第一部分CD36抑制对TBI后小鼠小胶质细胞极化以及脑白质功能的影响目的:建立创伤性脑损伤（TBI）后的白质损伤模型并探究抑制CD36受体对小鼠脑白质损伤情况、神经功能恢复情况以及损伤周围小胶质细胞极化情况的影响。方法:将108只C57小鼠随机分为Sham组（n=36）、TBI组（n=36）和SSO组（n=36）。在CCI造模后的不同时间对各组小鼠进行神经行为学实验以观察神经功能恢复情况。在造模第7天对各组小鼠脑组织进行HE染色、LFB染色、免疫荧光染色、透射电镜观察以及实时荧光定量PCR（q PCR）,以观察小胶质细胞极化情况和白质损伤恢复情况。在造模第35天将各组小鼠脑组织进行LFB染色、免疫荧光染色和透射电镜观察,以观察远期白质损伤恢复程度。结果:HE染色显示TBI与SSO组小鼠脑组织都出现损伤,但SSO组小鼠脑组织损伤程度较TBI组小;LFB染色显示TBI与SSO组小鼠都出现脱髓鞘表现,而SSO组小鼠的脱髓鞘程度较TBI组轻;免疫荧光显示SSO组的MBP荧光强度比TBI组强,而SSO组的SMI-32的荧光强度比TBI组弱;电镜观察发现,TBI与SSO组的轴突均出现脱髓鞘表现,但SSO组较TBI组轻;神经行为学实验表明,SSO组的神经功能恢复程度较TBI组恢复程度高;免疫荧光细胞计数显示Sham组未见共染细胞,TBI组和SSO组均可见i NOS+与Arg1+细胞,且SSO组中Arg1+细胞数量显著大于TBI组,而i NOS+细胞数量显著小于TBI组;q PCR检测,显示SSO组的i NOS和CD16的m RNA表达量显著低于TBI组而显著高于Sham组;TBI组的TGF-β和CD206的m RNA表达量显著低于SSO组而显著高于Sham组。结论:成功利用CCI模型建立了创伤性白质损伤并发现明显的髓鞘损伤和少突胶质细胞减少以及小胶质细胞聚集。此外,发生创伤性白质损伤后,CD36抑制剂对白质结构与功能的修复有明显促进作用。最后,CD36抑制剂可以抑制小鼠脑组织损伤周围区M1型小胶质细胞的形成,促进M2型小胶质细胞增多。第二部分CD36调控M1与M2亚型小胶质细胞形成的机制目的:采用了体外细胞实验,进一步明确CD36受体调控M1与M2型小胶质细胞形成的机制。方法:BV2细胞通过慢病毒敲减得到CD36敲减的BV2稳定细胞株。利用LPS干预BV2与CD36敲减的BV2细胞以观察细胞表型以及探究内在机制。因此,将细胞分为BV2组、CD36-KD BV2组、LPS BV2组和LPS CD36-KD BV2组,细胞在培养箱中孵育24h后收集以进行细胞免疫荧光染色、q PCR检测、Griess法检测NO以及Western blot检测。结果:CD36-KD BV2组与BV2组相比CD36 m RNA与蛋白的相对表达量显著下降,其余检测指标无明显差异;q PCR、免疫荧光染色与NO表达水平测定结果显示,LPS BV2组的i NOS、CD16 m RNA相对表达量、CD16/32+细胞密度以及NO含量较BV2组有显著上升,而TGF-β与CD206m RNA与CD206+细胞密度较BV2组显著下降,同时LPS CD36-KD BV2组相较于LPS BV2组i NOS与CD16的m RNA表达量、CD16/32+细胞密度以及NO含量明显减少,而TGF-β与CD206的m RNA表达量、CD206+细胞密度明显增加;WB结果显示,LPS BV2组与LPS CD36-KD BV2组的ERK1/2、JNK、p38的磷酸化水平较BV2组均有所上升,其中LPS CD36-KD BV2组的p38磷酸化水平相比于LPS BV2组有所降低。结论:小胶质细胞表面存在CD36的表达,慢病毒RNA干扰小胶质细胞可以显著抑制小胶质细胞CD36的表达水平;此外,小胶质细胞经LPS刺激可以极化为M1型小胶质细胞,而抑制CD36可以促使经LPS诱导的M1型小胶质细胞向M2型转化;最后,小胶质细胞受到LPS刺激时MAPK通路磷酸化水平整体上调,而抑制CD36受体可以通过抑制p38的磷酸化从而使经LPS诱导的M1型小胶质细胞向M2型转化。第三部分抑制CD36通过调控小胶质细胞极化减轻白质损伤目的:采用了小胶质细胞条件性培养基进行实验,进一步明确抑制CD36减轻白质损伤的机制。方法:根据CD36是否被敲减以及是否使用LPS干预,小胶质细胞被分为BV2组、CD36-KD BV2组、LPS BV2组和LPS CD36-KD BV2组,同时,少突胶质细胞进行氧糖剥夺（OGD）处理2h,再正常培养24小时。收集各组小胶质细胞的培养基加入到少突胶质细胞培养基中,少突胶质细胞根据培养基的来源同样分为BV2组、CD36-KD BV2组、LPS BV2组和LPS CD36-KD BV2组。培养箱中孵育24h后,对各组OGD少突胶质细胞进行细胞免疫荧光染色、CCK-8检测与LDH释放检测。结果:免疫荧光染色、CCK-8与LDH释放量检测结果显示,BV2组与CD36-KD BV2组的少突胶质细胞的MBP表达量、细胞活力、LDH释放量无明显差别,并且分支结构复杂度无明显差别;LPS BV2组的少突胶质细胞MBP表达量、分支结构复杂度与细胞活力相比于BV2组显著降低,而LDH释放量显著上升;LPS CD36-KD BV2组的少突胶质细胞MBP表达量、分支结构复杂度与细胞活力较LPS BV2组明显增加,而LDH释放量显著减少。结论:氧糖剥夺实验可以导致少突胶质细胞细胞活力与功能下降,以及细胞膜通透性增高;此外,LPS诱导后BV2细胞的细胞因子能够加重OGD少突胶质细胞的损伤,而抑制BV2细胞的CD36受体可以明显缓解这种加重损伤的效应。综上,在TBI后抑制CD36可以抑制MAPK通路中p38的磷酸化水平,从而促进小胶质细胞从M1型转化为M2型,进而减轻TBI导致的白质损伤,促进白质结构和功能的恢复。