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背景:肝窦阻塞综合征(Sinusoidal obstruction syndrome，SOS)是由于肝窦内皮细胞损伤致肝窦流出道阻塞继而引起肝内窦性门脉高压，临床主要表现为腹水、黄疸、肝肿大以及肝区疼痛等，严重者发展为肝硬化，需要肝移植，甚至死亡。SOS可由多种原因引起，目前认为摄入中草药所含的肝毒性成分吡咯里西啶类生物碱(Pyrrolizidine alkaloid，PA)、干细胞移植、肝切除手术以及服用某些化疗药物如环磷酰胺(Cyclophosphamide，CPA)等是导致SOS的主要原因。SOS的发病机制目前尚不明确，临床上尚无特效治疗药物，患者预后差，晚期患者只有接受肝移植才能延长生存期。 甘草苷(Liquiritin，LQ)与甘草素(Liquiritigenin，LG)是中药甘草所含的主要化学成分，具有优良的抗炎活性，可抑制脂多糖引起的炎性介质表达升高，甘草素还可以拮抗对乙酰氨基酚或半乳糖/脂多糖引起的肝损伤，但是甘草苷与甘草素是否对SOS具有改善作用，尚未见报道。 目的:本课题主要在体内动物、体外细胞水平，研究损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)-Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)-髓样分化早期反应因子88(Myeloid differentiation primary response gene88，MyD88)/可诱导β-干扰素的TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containingadapter-inducing interferon-β，TRIF)-核转录因子κB(Nuclear factorκB，NFκB)介导的炎性损伤在SOS形成中的重要作用，并在此基础上观察甘草素(Liquiritigenin，LG)和甘草苷(Liquiritin，LQ)对PA野百合碱(Monocrotaline，MCT)和化疗药环磷酰胺(CPA)造成SOS的改善作用及其机制，为临床上SOS的治疗提供策略，也为甘草素和甘草苷在SOS治疗中的潜在应用提供实验依据。 方法: 1.以不同剂量MCT或CPA给药小鼠诱导形成SOS，并给药甘草素(LG)和甘草苷(LQ)进行治疗。通过血清生化指标检测、肝组织病理分析、肝组织扫描电镜分析及肝组织基质金属蛋白酶-9(Metalloproteinase-9，MMP-9)表达的检测，评价肝毒性和SOS的形成，以及LG和LQ是否对SOS具有改善作用。 2.采用免疫组化实验检测小鼠肝组织中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，比色法检测小鼠肝组织髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活力，酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测小鼠血清中白细胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)与肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNFα)等炎性因子的含量，评价动物肝脏的炎性损伤程度以及LG和LQ对炎性肝损伤的改善作用。 3.采用Western-blot、Real-time PCR等实验方法，检测TLRs-MyD88/TRIF-NFκB信号通路在MCT或CPA所诱导的SOS中是否被激活，以及LG和LQ是否能够抑制该信号通路的激活。 4.采用Western-blot、Real-time PCR等实验方法，检测MCT或CPA是否通过诱导高速泳动族框蛋白-1(High mobility group box-1 protein，HMGB-1)、热休克蛋白60(Heat shock protein60，HSP60)、葡萄糖调节蛋白94(Glucose regulatedprotein94，grp94)等DAMPs的释放而激活TLRs-MyD88/TRIF-NFκB信号通路，以及LG和LQ能否减少MCT/CPA引起的DAMPs释放。 5.分别在MyD88或TRIF基因敲除(MyD88-KO，TRIF-KO)小、鼠上，采用MCT诱导SOS，通过动物血清生化指标检测、肝组织病理分析、肝组织扫描电镜分析及肝组织MMP-9表达检测等实验来评价动物肝损伤程度，以验证TLRs-MyD88/TRIF-NFκB信号通路在SOS形成过程中的重要作用。 6.检测实验动物肝组织中活性氧形成(Reactive oxygen species，ROS)与丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，评价动物肝组织氧应激损伤程度，以及LG和LQ改善氧应激肝损伤的作用。 结果: 1.不同剂量MCT或CPA给药后，小鼠血清中谷草转氨酶(Aspartatearminotransfcrase，AST)/谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)活力、肝组织中MMP-9的表达与空白组相比均显著上升;肝组织病理分析结果显示，给药MCT或CPA之后，小鼠肝组织出现肝细胞坏死，血管内皮损伤脱落，肝窦充血以及炎性细胞浸润等病变;肝组织扫描电镜分析结果则表明，给药组动物与空白组相比，肝窦内皮的完整性破坏严重，窦周孔显著扩张，并暴露出Disse间隙。LG和LQ给药大鼠后均可降低MCT或CPA诱导的血清ALT/AST升高、肝组织MMP-9表达的上升;改善MCT或CPA给药动物诱导的肝细胞坏死、血管内皮的损伤、肝窦充血等病变;改善肝窦窦周孔扩张并保护肝窦内皮完整性。以上结果表明MCT或CPA可诱导实验动物形成SOS; LG和LQ可改善MCT和CPA诱导的SOS。 2.不同剂量MCT或CPA给药后，小鼠肝组织中呈现不同程度的中性粒细胞、巨噬细胞的浸润;肝组织中MPO活性上升，血清中炎性因子水平升高。LG和LQ都可以减少MCT或CPA给药后诱导的肝组织中炎性细胞浸润，并降低肝组织MPO活性以及血清中炎性因子的含量。以上结果表明SOS发病过程中伴随着炎性损伤，而LG和LQ可通过降低炎性损伤而改善SOS。 3.不同剂量MCT或CPA给药后，小鼠肝组织中TLRs的表达上升、NFκB核转位增加;而LG和LQ可降低TLRs的升高，并减少NFκB的核转位激活。 4.不同剂量MCT或CPA给药动物可诱导DAMPs包括HMGB-1、HSP60与grp94的释放入血，而LG和LQ可减少MCT或CPA引起的上述DAMPs释放。不同浓度MCT与人肝窦内皮细胞(Human hepatic sinusoidal endothelial cells，HHSEC)孵育后可以诱导HMGB-1、HSP60与grp94从细胞内释放到细胞上清液中。 5.在MyD88或TRIF基因敲除小鼠上，给药MCT后，TRIF基因敲除小鼠中血清ALT/AST、肝组织MPO活性和MMP-9表达、肝组织病理分析、肝组织扫描电镜分析等结果显示，与野生型MCT给药小鼠相比均得到明显改善;而MyDS8基因敲除小鼠MCT给药后与野生型给药小鼠相比，以上各项指标的改善更为显著。这些结果提示DAMP s-TLRs-MyD88/TRIF-NFκB信号通路在SOS形成过程中具有重要的调控作用。 6.LG和LQ可降低MCT诱导的动物肝组织中MDA和ROS含量的上升，表明LG和LQ可改善MCT诱导的氧化应激肝损伤。 结论: 1.MCT与CPA均可诱导实验动物形成SOS。在SOS的发病过程中，肝窦内皮细胞损伤释放的DAMPs激活了TLRs-MyD88/TRIF-NFκB介导的炎性信号通路，诱导了肝脏炎性损伤的发生，进一步促进了SOS的形成。 2.LG和LQ均可以明显改善MCT或CFA诱导的实验动物SOS形成，机制可能与其抑制DAMPs-TLRs-MyD88/TRIF-NFκB信号通路、减少炎性肝损伤有关。 3.LG和LQ还可以通过抑制氧应激肝损伤，进一步缓解MCT诱导的SOS。