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研究背景
吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)是一种典型的针对周围神经系统的自身免疫性疾病，是最常见和严重的急性弛缓性神经病之一。尽管很多病人能够从目前的标准治疗方案中获益，GBS仍然具有潜在的致命性和严重的致残性。急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy，AIDP)是GBS的主要亚型之一，自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)是广为接受的AIDP的动物模型。通过对EAN及人体病理资料的研究，现已明确，巨噬细胞及CD4+T细胞在EAN/AIDP的发病中起主要作用。
巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分，根据周围环境的变化，巨噬细胞的表型及功能具有高度的可塑性。M1型巨噬细胞可被炎症性刺激及1型辅助性T细胞(T helper 1，Th1)来源的干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)活化，进而调节适应性免疫的强度。目前认为，M1型巨噬细胞在EAN/AIDP的进展期发挥重要作用。而M2型巨噬细胞可在Th2反应中产生，在EAN的炎症消退及组织修复中发挥作用。由于在炎症的产生及消退中的双重作用，巨噬细胞已经成为GBS及其他炎性疾病中的一个极具希望的干预靶点。巨噬细胞功能的调节和发挥依赖于它们和其他细胞之间精细的通讯，因此，深入探索巨噬细胞和其他细胞的相互作用网络是至关重要的。
外泌体(exosomes)是细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的一种，直径50至150nm。外泌体能够携带功能性的核酸、蛋白质及脂质成分，介导这些成分的细胞间交换，拓展了我们对于细胞间通讯方式的认识。越来越多的研究表明，外泌体介导的细胞间通讯对于巨噬细胞在多种生理及病理条件下的功能发挥具有重要意义。然而，巨噬细胞源性外泌体在EAN/GBS及其他炎性疾病中的作用及机制尚不清楚。
研究目的
一、探讨M1及M2型巨噬细胞源性外泌体对EAN发病的影响及免疫学机制，从而为GBS及其他炎性疾病的治疗提供新的靶点。
二、探讨巨噬细胞源性外泌体对T细胞的调节作用，拓宽对巨噬细胞与T细胞相互作用网络的认识，为开发针对巨噬细胞的靶向疗法提供新的候选靶点和实验依据。
研究方法
第一部分
1.骨髓源巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages，BMDM)的培养取6-8周龄的Lewis大鼠股骨和胫骨，制备骨髓单个核细胞(mononuclear cells，MNC)悬液，利用重组大鼠M-CSF诱导骨髓前体细胞向BMDM分化。
2.BMDM的极化
利用LPS和重组大鼠IFN-γ诱导BMDM向M1型巨噬细胞极化，通过Griess法检测上清中一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量，通过ELISA检测上清中白介素-12(interleukin-12，IL-12)的产生;利用重组大鼠IL-4诱导M2型巨噬细胞极化，通过流式细胞术检测CD163和CD206的表达。
3.外泌体的分离及鉴定
分别收集极化后的M1及M2型巨噬细胞的细胞培养上清液，通过差速离心法(differential centrifugation)，制备得到M1型巨噬细胞源性外泌体(M1外泌体)及M2型巨噬细胞源性外泌体(M2外泌体)。利用透射电镜确定外泌体形态特征;利用流式细胞术和免疫印迹检测外泌体表面和内部标志物;利用纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)检测外泌体粒径分布。
4.EAN模型的构建和外泌体处理
利用提取自牛马尾神经的牛周围神经髓鞘素(bovine peripheral myelin，BPM)配合弗氏佐剂、结核菌素于Lewis大鼠尾根部皮下注射构建EAN模型。随机分为3组，于免疫后第5、7、9、11天分别给予M1外泌体、M2外泌体或等量溶剂对照，每日评估神经系统症状并记录体重。于免疫后第13天对各组大鼠施以安乐死，收集双侧腹股沟淋巴结、脾脏、坐骨神经进行检测。
5.组织学
大鼠坐骨神经，经固定、脱水、石蜡包埋、切片后，利用HE染色检测坐骨神经炎性细胞浸润的程度;通过Luxolfastblue染色评估坐骨神经脱髓鞘程度。
6.巨噬细胞来源外泌体的体内免疫调节作用
制备淋巴结、脾脏的MNC悬液，利用流式细胞术检测M1和M2外泌体对Th细胞亚型、调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)、生发中心B细胞(germinal center B cells，GCB)及固有免疫系统的特定细胞组分的影响。
7.统计分析
使用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，分别利用Shapiro-Wilktest和Levenestest对数据正态性及方差齐性进行检验，符合正态分布的数据，利用Studentst-test或单因素ANOVA进行假设检验，根据方差齐性，选择LSDtest或DunnettsT3test进行多重比较;不符合正态分布的数据，利用非参数检验进行假设检验。
第二部分
1.M1外泌体及M2外泌体的制备
制备Lewis大鼠股骨和胫骨骨髓MNC悬液，利用M-CSF的诱导骨髓前体细胞分化获得BMDM。去除分化培养基后，利用LPS和重组大鼠IFN-γ诱导M1型巨噬细胞极化，利用重组大鼠IL-4诱导M2型巨噬细胞极化。收集极化巨噬细胞的细胞培养上清液，差速离心法分别制备M1外泌体及M2外泌体。
2.巨噬细胞源性外泌体与脾脏MNC共培养
制备脾脏MNC，与M1或M2外泌体共培养，利用流式细胞术和ELISA检测外泌体对T细胞IFN-γ产生的影响，利用流式细胞术检测外泌体对T细胞增殖、凋亡的影响。
3.M1外泌体与骨髓源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDC)共培养
利用GM-CSF和IL-4诱导骨髓前体细胞分化获得BMDC，与M1外泌体共培养，并利用LPS诱导BMDC成熟，流式细胞术检测CD80及MHCⅡ的表达以反映M1外泌体对BMDC的成熟度的影响。
4.M1外泌体对T细胞的直接作用
利用磁珠分选获得脾脏T细胞，与亲脂性荧光染料PKH26标记的M1和M2外泌体共培养，荧光显微镜下观察T细胞是否可以摄取外泌体;将纯化的T细胞与M1外泌体共培养，利用流式细胞术检测M1外泌体对T细胞IFN-γ产生的影响。
5.统计分析
使用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，首先对数据的正态性及方差齐性进行检验，符合正态分布的数据，利用Studentst-test或单因素ANOVA进行假设检验，利用LSDtest或DunnettsT3test进行多重比较;不符合正态分布的数据，利用非参数检验进行假设检验。
研究结果
第一部分
1.BMDM的极化
LPS和IFN-γ处理的BMDM产生了NO和IL-12，表明BMDM被成功极化为M1型巨噬细胞;IL-4处理的BMDM上调CD163和CD206的表达，证实了M2型巨噬细胞的极化状态。
2.外泌体鉴定
通过透射电镜观察，差速离心法所制备的外泌体具有典型形态学和尺寸特征;通过流式细胞术检测，所制备的巨噬细胞外泌体表达外泌体标志物CD81;通过免疫印迹法检测，所制备的外泌体表达外泌体标志物TSG101和ALIX;NTA显示符合小EV的粒径分布。
3.M1外泌体能够加重EAN，M2外泌体具有减轻EAN症状的潜能
通过对EAN大鼠临床症状的评估，M1外泌体能够促进EAN的发展，而M2外泌体可观察到缓解EAN症状严重程度的潜能。通过组织学评估坐骨神经炎性细胞浸润和脱髓鞘程度，进一步确认了M1外泌体对EAN的加重作用及M2外泌体减轻EAN症状的潜能。
4.M1和M2外泌体对适应性免疫的调节作用
与对照组相比，M1外泌体处理能够增加Th1、Th17细胞的比例;尽管M2外泌体能够降低脾脏中CD4+T细胞的比例，但不能限制Th1和Th17细胞的分化。而M1和M2外泌体对Treg的比例无显著影响。M1和M2外泌体均能够增加GCB的比例，这种促进作用可能与T细胞表面ICOS的表达升高有关。
5.M1和M2外泌体对脾脏自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)及巨噬细胞的作用
M1和M2外泌体对脾脏NK细胞的比例及脾脏巨噬细胞共刺激分子CD80、CD86的表达无显著影响。
第二部分
1.M1和M2外泌体对T细胞IFN-γ产生的影响
在体外将M1和M2外泌体与脾脏MNC共培养后，我们发现M1外泌体能够促进CD4+T细胞及CD8+T细胞IFN-γ的产生，并且这种作用有剂量依赖效应，而M2外泌体则不能限制T细胞IFN-γ的产生。
2.M1和M2外泌体对T细胞增殖、凋亡的影响
M1外泌体能够促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖，M2外泌体对T细胞的增殖及凋亡尚无显著影响;M1和M2外泌体对T细胞的凋亡无显著影响。
3.M1外泌体对BMDC成熟度的影响
M1外泌体不能够进一步促进LPS诱导的BMDC表面CD80和MHCⅡ表达的上调。
4.M1外泌体能够直接促进T细胞IFN-γ的产生
将纯化的T细胞与荧光标记的外泌体孵育后，M1和M2外泌体都能够被T细胞所摄取。进一步将M1外泌体与纯化的T细胞共培养后，M1外泌体能够剂量依赖地促进CD4+T细胞及CD8+T细胞IFN-γ的产生，表明M1外泌体对T细胞的分化及效应功能具有直接的调控作用。
研究结论
一、M1外泌体能够促进EAN的发展，这种作用部分是通过对Th1及Th17反应的调节实现的;M2外泌体具有缓解EAN症状的潜能，其作用可能不是通过调节Th亚型分化而实现的。
二、M1外泌体能够调控T细胞的增殖及IFN-γ的产生;这种调控可通过M1外泌体对T细胞的直接作用而实现。
吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)是一种典型的针对周围神经系统的自身免疫性疾病，是最常见和严重的急性弛缓性神经病之一。尽管很多病人能够从目前的标准治疗方案中获益，GBS仍然具有潜在的致命性和严重的致残性。急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy，AIDP)是GBS的主要亚型之一，自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis，EAN)是广为接受的AIDP的动物模型。通过对EAN及人体病理资料的研究，现已明确，巨噬细胞及CD4+T细胞在EAN/AIDP的发病中起主要作用。
巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分，根据周围环境的变化，巨噬细胞的表型及功能具有高度的可塑性。M1型巨噬细胞可被炎症性刺激及1型辅助性T细胞(T helper 1，Th1)来源的干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)活化，进而调节适应性免疫的强度。目前认为，M1型巨噬细胞在EAN/AIDP的进展期发挥重要作用。而M2型巨噬细胞可在Th2反应中产生，在EAN的炎症消退及组织修复中发挥作用。由于在炎症的产生及消退中的双重作用，巨噬细胞已经成为GBS及其他炎性疾病中的一个极具希望的干预靶点。巨噬细胞功能的调节和发挥依赖于它们和其他细胞之间精细的通讯，因此，深入探索巨噬细胞和其他细胞的相互作用网络是至关重要的。
外泌体(exosomes)是细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的一种，直径50至150nm。外泌体能够携带功能性的核酸、蛋白质及脂质成分，介导这些成分的细胞间交换，拓展了我们对于细胞间通讯方式的认识。越来越多的研究表明，外泌体介导的细胞间通讯对于巨噬细胞在多种生理及病理条件下的功能发挥具有重要意义。然而，巨噬细胞源性外泌体在EAN/GBS及其他炎性疾病中的作用及机制尚不清楚。
研究目的
一、探讨M1及M2型巨噬细胞源性外泌体对EAN发病的影响及免疫学机制，从而为GBS及其他炎性疾病的治疗提供新的靶点。
二、探讨巨噬细胞源性外泌体对T细胞的调节作用，拓宽对巨噬细胞与T细胞相互作用网络的认识，为开发针对巨噬细胞的靶向疗法提供新的候选靶点和实验依据。
研究方法
第一部分
1.骨髓源巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages，BMDM)的培养取6-8周龄的Lewis大鼠股骨和胫骨，制备骨髓单个核细胞(mononuclear cells，MNC)悬液，利用重组大鼠M-CSF诱导骨髓前体细胞向BMDM分化。
2.BMDM的极化
利用LPS和重组大鼠IFN-γ诱导BMDM向M1型巨噬细胞极化，通过Griess法检测上清中一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量，通过ELISA检测上清中白介素-12(interleukin-12，IL-12)的产生;利用重组大鼠IL-4诱导M2型巨噬细胞极化，通过流式细胞术检测CD163和CD206的表达。
3.外泌体的分离及鉴定
分别收集极化后的M1及M2型巨噬细胞的细胞培养上清液，通过差速离心法(differential centrifugation)，制备得到M1型巨噬细胞源性外泌体(M1外泌体)及M2型巨噬细胞源性外泌体(M2外泌体)。利用透射电镜确定外泌体形态特征;利用流式细胞术和免疫印迹检测外泌体表面和内部标志物;利用纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)检测外泌体粒径分布。
4.EAN模型的构建和外泌体处理
利用提取自牛马尾神经的牛周围神经髓鞘素(bovine peripheral myelin，BPM)配合弗氏佐剂、结核菌素于Lewis大鼠尾根部皮下注射构建EAN模型。随机分为3组，于免疫后第5、7、9、11天分别给予M1外泌体、M2外泌体或等量溶剂对照，每日评估神经系统症状并记录体重。于免疫后第13天对各组大鼠施以安乐死，收集双侧腹股沟淋巴结、脾脏、坐骨神经进行检测。
5.组织学
大鼠坐骨神经，经固定、脱水、石蜡包埋、切片后，利用HE染色检测坐骨神经炎性细胞浸润的程度;通过Luxolfastblue染色评估坐骨神经脱髓鞘程度。
6.巨噬细胞来源外泌体的体内免疫调节作用
制备淋巴结、脾脏的MNC悬液，利用流式细胞术检测M1和M2外泌体对Th细胞亚型、调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)、生发中心B细胞(germinal center B cells，GCB)及固有免疫系统的特定细胞组分的影响。
7.统计分析
使用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，分别利用Shapiro-Wilktest和Levenestest对数据正态性及方差齐性进行检验，符合正态分布的数据，利用Studentst-test或单因素ANOVA进行假设检验，根据方差齐性，选择LSDtest或DunnettsT3test进行多重比较;不符合正态分布的数据，利用非参数检验进行假设检验。
第二部分
1.M1外泌体及M2外泌体的制备
制备Lewis大鼠股骨和胫骨骨髓MNC悬液，利用M-CSF的诱导骨髓前体细胞分化获得BMDM。去除分化培养基后，利用LPS和重组大鼠IFN-γ诱导M1型巨噬细胞极化，利用重组大鼠IL-4诱导M2型巨噬细胞极化。收集极化巨噬细胞的细胞培养上清液，差速离心法分别制备M1外泌体及M2外泌体。
2.巨噬细胞源性外泌体与脾脏MNC共培养
制备脾脏MNC，与M1或M2外泌体共培养，利用流式细胞术和ELISA检测外泌体对T细胞IFN-γ产生的影响，利用流式细胞术检测外泌体对T细胞增殖、凋亡的影响。
3.M1外泌体与骨髓源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDC)共培养
利用GM-CSF和IL-4诱导骨髓前体细胞分化获得BMDC，与M1外泌体共培养，并利用LPS诱导BMDC成熟，流式细胞术检测CD80及MHCⅡ的表达以反映M1外泌体对BMDC的成熟度的影响。
4.M1外泌体对T细胞的直接作用
利用磁珠分选获得脾脏T细胞，与亲脂性荧光染料PKH26标记的M1和M2外泌体共培养，荧光显微镜下观察T细胞是否可以摄取外泌体;将纯化的T细胞与M1外泌体共培养，利用流式细胞术检测M1外泌体对T细胞IFN-γ产生的影响。
5.统计分析
使用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，首先对数据的正态性及方差齐性进行检验，符合正态分布的数据，利用Studentst-test或单因素ANOVA进行假设检验，利用LSDtest或DunnettsT3test进行多重比较;不符合正态分布的数据，利用非参数检验进行假设检验。
研究结果
第一部分
1.BMDM的极化
LPS和IFN-γ处理的BMDM产生了NO和IL-12，表明BMDM被成功极化为M1型巨噬细胞;IL-4处理的BMDM上调CD163和CD206的表达，证实了M2型巨噬细胞的极化状态。
2.外泌体鉴定
通过透射电镜观察，差速离心法所制备的外泌体具有典型形态学和尺寸特征;通过流式细胞术检测，所制备的巨噬细胞外泌体表达外泌体标志物CD81;通过免疫印迹法检测，所制备的外泌体表达外泌体标志物TSG101和ALIX;NTA显示符合小EV的粒径分布。
3.M1外泌体能够加重EAN，M2外泌体具有减轻EAN症状的潜能
通过对EAN大鼠临床症状的评估，M1外泌体能够促进EAN的发展，而M2外泌体可观察到缓解EAN症状严重程度的潜能。通过组织学评估坐骨神经炎性细胞浸润和脱髓鞘程度，进一步确认了M1外泌体对EAN的加重作用及M2外泌体减轻EAN症状的潜能。
4.M1和M2外泌体对适应性免疫的调节作用
与对照组相比，M1外泌体处理能够增加Th1、Th17细胞的比例;尽管M2外泌体能够降低脾脏中CD4+T细胞的比例，但不能限制Th1和Th17细胞的分化。而M1和M2外泌体对Treg的比例无显著影响。M1和M2外泌体均能够增加GCB的比例，这种促进作用可能与T细胞表面ICOS的表达升高有关。
5.M1和M2外泌体对脾脏自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)及巨噬细胞的作用
M1和M2外泌体对脾脏NK细胞的比例及脾脏巨噬细胞共刺激分子CD80、CD86的表达无显著影响。
第二部分
1.M1和M2外泌体对T细胞IFN-γ产生的影响
在体外将M1和M2外泌体与脾脏MNC共培养后，我们发现M1外泌体能够促进CD4+T细胞及CD8+T细胞IFN-γ的产生，并且这种作用有剂量依赖效应，而M2外泌体则不能限制T细胞IFN-γ的产生。
2.M1和M2外泌体对T细胞增殖、凋亡的影响
M1外泌体能够促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖，M2外泌体对T细胞的增殖及凋亡尚无显著影响;M1和M2外泌体对T细胞的凋亡无显著影响。
3.M1外泌体对BMDC成熟度的影响
M1外泌体不能够进一步促进LPS诱导的BMDC表面CD80和MHCⅡ表达的上调。
4.M1外泌体能够直接促进T细胞IFN-γ的产生
将纯化的T细胞与荧光标记的外泌体孵育后，M1和M2外泌体都能够被T细胞所摄取。进一步将M1外泌体与纯化的T细胞共培养后，M1外泌体能够剂量依赖地促进CD4+T细胞及CD8+T细胞IFN-γ的产生，表明M1外泌体对T细胞的分化及效应功能具有直接的调控作用。
研究结论
一、M1外泌体能够促进EAN的发展，这种作用部分是通过对Th1及Th17反应的调节实现的;M2外泌体具有缓解EAN症状的潜能，其作用可能不是通过调节Th亚型分化而实现的。
二、M1外泌体能够调控T细胞的增殖及IFN-γ的产生;这种调控可通过M1外泌体对T细胞的直接作用而实现。