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研究背景
下咽癌发病率相对较低，临床上95％的肿瘤患者病理类型为鳞状细胞癌。区域癌变和黏膜下浸润是下咽癌的病理学特征。根据下咽癌肿瘤发病部位差异分为以下三种:梨状窝、环后及下咽后壁癌。由于下咽癌肿瘤生长部位结构相对特殊，发病隐蔽，早期症状类似于常见的咽喉部良性病变，因此有些患者就诊时往往以颈部淋巴结肿大就诊。目前，以外科手术兼顾辅助性治疗是下咽癌治疗的主要方式，虽然目前诱导化疗及放化疗方案不断丰富和优化，同时还有生物靶向治疗在下咽癌中的进一步应用，下咽癌患者的5年生存率仍为30％-35％左右，并没有得到明显提高。下咽癌患者的预后不仅与原发肿瘤局部控制有关，还与远处转移相关。总之，下咽癌生物行为恶劣是下咽癌预后不良的重要原因，因此探寻下咽癌进展及浸润转移的潜在分子机制，并对关键靶点给予针对干预，能够提高下咽癌患者的生存。
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDPK1，PDK1)与调控PI3K/Akt信号通路的活性密切相关，对维持细胞的存活、凋亡等生理学功能必不可少。在肿瘤组织中PDK1一般为高表达，贯穿于肿瘤发展整个进程，而且对于患者预后具有一定的预测作用。近年来，针对PDK1多种抑制剂在研发之中，将有望为肿瘤患者提供个体化治疗。但是目前PDK1在肿瘤浸润转移中发挥的作用及潜在分子机制还未完全阐明，因此对这一机制的研究，有利于寻找潜在作用靶点，进而采取适当的措施降低下咽癌的恶性进展，改善下咽癌患者的预后。
上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤转移中扮演的角色及相关机制研究一直备受国内外研究者的关注。转移是恶性肿瘤治疗失败的主要原因，而现在对于肿瘤转移的过程缺少更进一步的认识。目前认为肿瘤转移起始于肿瘤细胞在某些条件下脱离原发肿瘤，后经过血液及淋巴管等各种途径，达到适宜的组织中寄居增殖，从而形成转移性肿瘤的过程，EMT能够推动肿瘤细胞的迁移和运动。
Notch信号通路在多种肿瘤中上调或下调，在肿瘤各个方面均起调控作用。Notch信号通路因研究果蝇的过程中所被人熟知。Notch信号通路由特异性的受体与配体组成，这种特异性结合传递信号发出细胞的信息，是Notch信号通路激活的初始阶段，随后Notch受体蛋白接收到信号后，发动多次蛋白水解过程，胞内段NICD最终在γ-内分泌酶(γ-secretase)最后一步水解的作用下脱落进入胞质中，最终进入胞核内激活Hes、HEY等在内的下游作用因子，在细胞生物学功能中扮演者重要的角色。随着研究的不断深入，大量实验表明Notch信号通路与子宫内膜癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤恶性进展密切相关。
我们已发表的研究成果显示Notch1信号通路的活性与下咽癌细胞的迁移侵袭能力相关。此外，PDK1依赖Notch的转录程序促进角质细胞的分化。在T淋巴细胞的发育过程中，PDK1对于Notch介导的胸腺细胞营养和增殖反应起着广泛的调控作用。在胆囊癌中，上皮间质转化可能参与了PDK1引起的恶性肿瘤行为。但是PDK1能否在肿瘤尤其是下咽癌中调控Notch信号通路的活性目前尚不清楚，同时PDK1是否在上皮间质转化过程中发挥作用需进一步阐明。
立足于以上研究背景，我们首先对PDK1在下咽癌组织中的表达情况进行研究，明确其表达的基础上，进一步探究其对下咽癌增殖以及侵袭转移的影响。此外，通过分子机制研究探讨PDK1能否通过Notch1信号通路促进下咽癌进展。本课题通过对PDK1作用机制的研究为下咽癌侵袭转移的调控机制提供了新视野，有望为下咽癌临床诊治提供新的肿瘤标志物和靶标选择。
研究目的
探究PDK1在下咽癌中的表达及功能，并进一步尝试阐述发挥作用相关潜在机制，为下咽癌靶向治疗提供理论依据。
方法
1.下咽癌组织中PDK1的表达及临床意义
(1)PDK1蛋白在组织中的表达采用免疫组化技术，根据染色进行评分，依据PDK1在肿瘤组织的总体评分进行分组，一组为高表达组患者，另一组则为低表达组，并统计软件分析下咽癌患者PDK1高低表达情况与患者临床病理参数的相关性。
(2)统计学分析PDK1的表达与患者术后存活时间之间的关系，探究PDK1对下咽癌患者的预后意义。
(3)利用Westernblot方法检测8对随机抽选的下咽癌组织中的PDK1蛋白的表达，进一步验证其在下咽癌组织中的表达。
2.体外研究PDK1对下咽癌肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响
(1)慢病毒感染的方法构建PDK1高表达和沉默的稳转FaDu细胞株，Westernblot检测慢病毒感染效率。
(2)利用CCK8和软琼脂克隆形成实验检测PDK1对下咽癌细胞增殖活性及克隆形成能力的影响。
(3)Transwell小室实验测定PDK1表达程度对下咽癌细胞迁移和侵袭能力的调控。
3.体内明确PDK1对下咽癌增殖和转移的影响
(1)采用裸鼠皮下成瘤实验，将稳定沉默PDK1的FaDu细胞用注射器注射至裸鼠右侧皮下，测量生成的瘤体体积及重量判断PDK1在体内对于下咽癌增殖的影响。
(2)关于PDK1在体内对于肿瘤细胞远处转移的影响采用尾静脉注射肺转移实验。细胞经过尾静脉注射入体内，8周后将裸鼠的肺部解剖制作切片并HE染色，显微镜下观察转移癌结节生成的数量。
4.PDK1促进下咽癌侵袭转移的分子机制研究
(1)明确PDK1通过Notch1信号通路诱导EMT进而促进下咽癌的浸润转移。首先Westernblot检测沉默PDK1表达后EMT相关上皮及间质细胞标志物、NICD1及Hes1的表达。进一步在过表达PDK1的稳转FaDu细胞株中用小干扰RNA抑制Notch1蛋白的表达或应用DAPT抑制γ-内分泌酶的形式抑制Notch1信号通路的活性，Westernblot检测EMT相关分子及Notch1信号通路NICD1与Hes1蛋白的表达情况。最后用Transwell小室实验检测两种不同方式抑制Notch1活性对PDK1所引起的迁移侵袭的影响。
(2)探明PDK1是否通过Akt的形式激活Notch1信号通路。首先利用MK2206(5μM)抑制Akt活性，Westernblot检测Notch1下游蛋白NICD1及Hes1。进一步在高表达PDK1的稳转FaDu细胞株中添加Akt抑制剂MK2206，Westernblot法检测NICD1及Hes1蛋白的表达变化。
(3)阐明PDK1对Notch1信号通路调控的具体分子机制。利用实时荧光定量PCR(Q-PCR)明确PDK1对Notch1转录水平的影响，进一步在转录后水平研究对Notch1活性分子NICD1蛋白的调控机制。通过免疫共沉淀实验检测PDK1与NICD1是否结合，然后采用泛素化实验检测PDK1对NICD1泛素化水平的影响。最后利用免疫荧光实验检测PDK1与NICD1在下咽癌肿瘤细胞中是否存在共表达。
结果
1.PDK1在下咽癌肿瘤组织中表达上调且与肿瘤恶性进展相关，PDK1高表达提示不良预后
(1)免疫组化以及Westernblot法结果均表明PDK1在下咽癌肿瘤组织中表达上调。
(2)分析结果显示PDK1与患者淋巴结转移程度、较晚临床分期及术后发生远处转移相关，与其它病理参数暂未发现相关性。
(3)PDK1高表达的患者生存期明显缩短。PDK1是下咽癌不良预后的独立危险因素。
2.在FaDu细胞中沉默PDK1的表达能够抑制下细胞的增殖活性和克隆形成能力，同时减弱迁移和侵袭
(1)感染Lv-PDK1-RNAi慢病毒能够沉默PDK1蛋白的表达。
(2)CCK8结果显示，稳定沉默PDK1的下咽癌细胞增殖活性明显降低。软琼脂克隆实验表明沉默PDK1表达后细胞克隆形成数量明显减少。
(3)Transwell实验结果显示，沉默PDK1表达后迁移和侵袭的肿瘤细胞数目明显减少。
3.过表达PDK1能够明显增强下咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭
(1)感染Lv-PDK1慢病毒成功使PDK1过表达。
(2)CCK8结果提示，过表达PDK1后下咽癌细胞增殖活性明显增强。软琼脂克隆形成实验提示过表达PDK1后肿瘤细胞克隆的数量明显增多。
(3)Transwell实验结果显示，过表达PDK1后下咽癌细胞迁移和侵袭的细胞数目显著增多。
4.PDK1在体内促进下咽癌肿瘤细胞的生长速度及转移能力
(1)在裸鼠皮下成瘤实验中，沉默PDK1表达后移植瘤增长速度减慢，且瘤体的重量也明显减轻。
(2)在裸鼠尾静脉注射肺转移实验中，沉默PDK1表达后下咽癌细胞在肺部形成的转移瘤数量明显减少。
5.PDK1通过Notch1信号通路诱导EMT及促进下咽癌迁移侵袭
(1)沉默PDK1表达后肿瘤细胞E-cadherin表达升高，而N-cadherin，Vimentin表达降低，Notch1信号通路中NICD1及Hes1表达显著降低。
(2)过表达PDK1后肿瘤细胞E-cadherin表达降低，N-cadherin、Vimentin、NICD1及Hes1表达升高。然而在过表达PDK1的稳转下咽癌细胞中通过转染Notch1-SiRNA及应用DAPT的方式抑制Notch1信号通路活性，E-cadherin表达升高，N-cadherin、Vimentin、NICD1和Hes1表达降低。
(3)在过表达PDK1的稳转肿瘤细胞中同样分别通过转染Notch1-SiRNA及应用DAPT的方式抑制Notch1信号通路活性，Transwell迁移和侵袭实验表明抑制Notch1通路活性均可以降低PDK1所引起的下咽癌迁移和侵袭能力。
6.PDK1通过非依赖Akt的形式激活Notch1信号通路
(1)采用Akt抑制剂MK2206处理下咽癌细胞后NICD1及Hes1的表达无明显变化。
(2)进一步在PDK1高表达稳转肿瘤细胞中应用MK2206，并不能逆转PDK1过表达引起的NICD1和Hes1表达的增多。
7.PDK1能够与NICD1结合，抑制其蛋白泛素化降解从而提高NICD1稳定性
(1)荧光定量PCR(Q-PCR)示干扰PDK1表达后Notch1在RNA水平上无明显变化。
(2)免疫共沉淀实验显示沉淀PDK1的细胞裂解液中能够检测到NICD1蛋白。
(3)NICD1抗体免疫共沉淀后，Westernblot检测NICD1泛素化表达水平。结果显示，PDK1过表达时，NICD1泛素化水平显著减弱。
(4)对PDK1和Notch1在肿瘤组织中的表达进行相关性分析，分析结果显示PDK1与Notch1的表达呈正相关。免疫荧光实验显示PDK1与NICD1在肿瘤细胞细胞质中共表达。
结论
1.PDK1在下咽癌肿瘤组织中表达上调且与肿瘤恶性进展相关，同时，PDK1高表达患者生存期缩短，提示不良预后。
2.PDK1在体外能促进下咽癌肿瘤细胞的增殖与侵袭转移。
3.PDK1在体内可以促进肿瘤的增殖及远处转移。
4.PDK1通过Notch1信号通路诱导下咽癌肿瘤细胞的EMT并促进肿瘤侵袭转移。
5.PDK1与NICD1在胞质中能够相互结合，进而抑制NICD1泛素化降解，上调NICD1蛋白的表达，从而引起Notch1信号通路的激活，促进下咽癌转移。
下咽癌发病率相对较低，临床上95％的肿瘤患者病理类型为鳞状细胞癌。区域癌变和黏膜下浸润是下咽癌的病理学特征。根据下咽癌肿瘤发病部位差异分为以下三种:梨状窝、环后及下咽后壁癌。由于下咽癌肿瘤生长部位结构相对特殊，发病隐蔽，早期症状类似于常见的咽喉部良性病变，因此有些患者就诊时往往以颈部淋巴结肿大就诊。目前，以外科手术兼顾辅助性治疗是下咽癌治疗的主要方式，虽然目前诱导化疗及放化疗方案不断丰富和优化，同时还有生物靶向治疗在下咽癌中的进一步应用，下咽癌患者的5年生存率仍为30％-35％左右，并没有得到明显提高。下咽癌患者的预后不仅与原发肿瘤局部控制有关，还与远处转移相关。总之，下咽癌生物行为恶劣是下咽癌预后不良的重要原因，因此探寻下咽癌进展及浸润转移的潜在分子机制，并对关键靶点给予针对干预，能够提高下咽癌患者的生存。
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDPK1，PDK1)与调控PI3K/Akt信号通路的活性密切相关，对维持细胞的存活、凋亡等生理学功能必不可少。在肿瘤组织中PDK1一般为高表达，贯穿于肿瘤发展整个进程，而且对于患者预后具有一定的预测作用。近年来，针对PDK1多种抑制剂在研发之中，将有望为肿瘤患者提供个体化治疗。但是目前PDK1在肿瘤浸润转移中发挥的作用及潜在分子机制还未完全阐明，因此对这一机制的研究，有利于寻找潜在作用靶点，进而采取适当的措施降低下咽癌的恶性进展，改善下咽癌患者的预后。
上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤转移中扮演的角色及相关机制研究一直备受国内外研究者的关注。转移是恶性肿瘤治疗失败的主要原因，而现在对于肿瘤转移的过程缺少更进一步的认识。目前认为肿瘤转移起始于肿瘤细胞在某些条件下脱离原发肿瘤，后经过血液及淋巴管等各种途径，达到适宜的组织中寄居增殖，从而形成转移性肿瘤的过程，EMT能够推动肿瘤细胞的迁移和运动。
Notch信号通路在多种肿瘤中上调或下调，在肿瘤各个方面均起调控作用。Notch信号通路因研究果蝇的过程中所被人熟知。Notch信号通路由特异性的受体与配体组成，这种特异性结合传递信号发出细胞的信息，是Notch信号通路激活的初始阶段，随后Notch受体蛋白接收到信号后，发动多次蛋白水解过程，胞内段NICD最终在γ-内分泌酶(γ-secretase)最后一步水解的作用下脱落进入胞质中，最终进入胞核内激活Hes、HEY等在内的下游作用因子，在细胞生物学功能中扮演者重要的角色。随着研究的不断深入，大量实验表明Notch信号通路与子宫内膜癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤恶性进展密切相关。
我们已发表的研究成果显示Notch1信号通路的活性与下咽癌细胞的迁移侵袭能力相关。此外，PDK1依赖Notch的转录程序促进角质细胞的分化。在T淋巴细胞的发育过程中，PDK1对于Notch介导的胸腺细胞营养和增殖反应起着广泛的调控作用。在胆囊癌中，上皮间质转化可能参与了PDK1引起的恶性肿瘤行为。但是PDK1能否在肿瘤尤其是下咽癌中调控Notch信号通路的活性目前尚不清楚，同时PDK1是否在上皮间质转化过程中发挥作用需进一步阐明。
立足于以上研究背景，我们首先对PDK1在下咽癌组织中的表达情况进行研究，明确其表达的基础上，进一步探究其对下咽癌增殖以及侵袭转移的影响。此外，通过分子机制研究探讨PDK1能否通过Notch1信号通路促进下咽癌进展。本课题通过对PDK1作用机制的研究为下咽癌侵袭转移的调控机制提供了新视野，有望为下咽癌临床诊治提供新的肿瘤标志物和靶标选择。
研究目的
探究PDK1在下咽癌中的表达及功能，并进一步尝试阐述发挥作用相关潜在机制，为下咽癌靶向治疗提供理论依据。
方法
1.下咽癌组织中PDK1的表达及临床意义
(1)PDK1蛋白在组织中的表达采用免疫组化技术，根据染色进行评分，依据PDK1在肿瘤组织的总体评分进行分组，一组为高表达组患者，另一组则为低表达组，并统计软件分析下咽癌患者PDK1高低表达情况与患者临床病理参数的相关性。
(2)统计学分析PDK1的表达与患者术后存活时间之间的关系，探究PDK1对下咽癌患者的预后意义。
(3)利用Westernblot方法检测8对随机抽选的下咽癌组织中的PDK1蛋白的表达，进一步验证其在下咽癌组织中的表达。
2.体外研究PDK1对下咽癌肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响
(1)慢病毒感染的方法构建PDK1高表达和沉默的稳转FaDu细胞株，Westernblot检测慢病毒感染效率。
(2)利用CCK8和软琼脂克隆形成实验检测PDK1对下咽癌细胞增殖活性及克隆形成能力的影响。
(3)Transwell小室实验测定PDK1表达程度对下咽癌细胞迁移和侵袭能力的调控。
3.体内明确PDK1对下咽癌增殖和转移的影响
(1)采用裸鼠皮下成瘤实验，将稳定沉默PDK1的FaDu细胞用注射器注射至裸鼠右侧皮下，测量生成的瘤体体积及重量判断PDK1在体内对于下咽癌增殖的影响。
(2)关于PDK1在体内对于肿瘤细胞远处转移的影响采用尾静脉注射肺转移实验。细胞经过尾静脉注射入体内，8周后将裸鼠的肺部解剖制作切片并HE染色，显微镜下观察转移癌结节生成的数量。
4.PDK1促进下咽癌侵袭转移的分子机制研究
(1)明确PDK1通过Notch1信号通路诱导EMT进而促进下咽癌的浸润转移。首先Westernblot检测沉默PDK1表达后EMT相关上皮及间质细胞标志物、NICD1及Hes1的表达。进一步在过表达PDK1的稳转FaDu细胞株中用小干扰RNA抑制Notch1蛋白的表达或应用DAPT抑制γ-内分泌酶的形式抑制Notch1信号通路的活性，Westernblot检测EMT相关分子及Notch1信号通路NICD1与Hes1蛋白的表达情况。最后用Transwell小室实验检测两种不同方式抑制Notch1活性对PDK1所引起的迁移侵袭的影响。
(2)探明PDK1是否通过Akt的形式激活Notch1信号通路。首先利用MK2206(5μM)抑制Akt活性，Westernblot检测Notch1下游蛋白NICD1及Hes1。进一步在高表达PDK1的稳转FaDu细胞株中添加Akt抑制剂MK2206，Westernblot法检测NICD1及Hes1蛋白的表达变化。
(3)阐明PDK1对Notch1信号通路调控的具体分子机制。利用实时荧光定量PCR(Q-PCR)明确PDK1对Notch1转录水平的影响，进一步在转录后水平研究对Notch1活性分子NICD1蛋白的调控机制。通过免疫共沉淀实验检测PDK1与NICD1是否结合，然后采用泛素化实验检测PDK1对NICD1泛素化水平的影响。最后利用免疫荧光实验检测PDK1与NICD1在下咽癌肿瘤细胞中是否存在共表达。
结果
1.PDK1在下咽癌肿瘤组织中表达上调且与肿瘤恶性进展相关，PDK1高表达提示不良预后
(1)免疫组化以及Westernblot法结果均表明PDK1在下咽癌肿瘤组织中表达上调。
(2)分析结果显示PDK1与患者淋巴结转移程度、较晚临床分期及术后发生远处转移相关，与其它病理参数暂未发现相关性。
(3)PDK1高表达的患者生存期明显缩短。PDK1是下咽癌不良预后的独立危险因素。
2.在FaDu细胞中沉默PDK1的表达能够抑制下细胞的增殖活性和克隆形成能力，同时减弱迁移和侵袭
(1)感染Lv-PDK1-RNAi慢病毒能够沉默PDK1蛋白的表达。
(2)CCK8结果显示，稳定沉默PDK1的下咽癌细胞增殖活性明显降低。软琼脂克隆实验表明沉默PDK1表达后细胞克隆形成数量明显减少。
(3)Transwell实验结果显示，沉默PDK1表达后迁移和侵袭的肿瘤细胞数目明显减少。
3.过表达PDK1能够明显增强下咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭
(1)感染Lv-PDK1慢病毒成功使PDK1过表达。
(2)CCK8结果提示，过表达PDK1后下咽癌细胞增殖活性明显增强。软琼脂克隆形成实验提示过表达PDK1后肿瘤细胞克隆的数量明显增多。
(3)Transwell实验结果显示，过表达PDK1后下咽癌细胞迁移和侵袭的细胞数目显著增多。
4.PDK1在体内促进下咽癌肿瘤细胞的生长速度及转移能力
(1)在裸鼠皮下成瘤实验中，沉默PDK1表达后移植瘤增长速度减慢，且瘤体的重量也明显减轻。
(2)在裸鼠尾静脉注射肺转移实验中，沉默PDK1表达后下咽癌细胞在肺部形成的转移瘤数量明显减少。
5.PDK1通过Notch1信号通路诱导EMT及促进下咽癌迁移侵袭
(1)沉默PDK1表达后肿瘤细胞E-cadherin表达升高，而N-cadherin，Vimentin表达降低，Notch1信号通路中NICD1及Hes1表达显著降低。
(2)过表达PDK1后肿瘤细胞E-cadherin表达降低，N-cadherin、Vimentin、NICD1及Hes1表达升高。然而在过表达PDK1的稳转下咽癌细胞中通过转染Notch1-SiRNA及应用DAPT的方式抑制Notch1信号通路活性，E-cadherin表达升高，N-cadherin、Vimentin、NICD1和Hes1表达降低。
(3)在过表达PDK1的稳转肿瘤细胞中同样分别通过转染Notch1-SiRNA及应用DAPT的方式抑制Notch1信号通路活性，Transwell迁移和侵袭实验表明抑制Notch1通路活性均可以降低PDK1所引起的下咽癌迁移和侵袭能力。
6.PDK1通过非依赖Akt的形式激活Notch1信号通路
(1)采用Akt抑制剂MK2206处理下咽癌细胞后NICD1及Hes1的表达无明显变化。
(2)进一步在PDK1高表达稳转肿瘤细胞中应用MK2206，并不能逆转PDK1过表达引起的NICD1和Hes1表达的增多。
7.PDK1能够与NICD1结合，抑制其蛋白泛素化降解从而提高NICD1稳定性
(1)荧光定量PCR(Q-PCR)示干扰PDK1表达后Notch1在RNA水平上无明显变化。
(2)免疫共沉淀实验显示沉淀PDK1的细胞裂解液中能够检测到NICD1蛋白。
(3)NICD1抗体免疫共沉淀后，Westernblot检测NICD1泛素化表达水平。结果显示，PDK1过表达时，NICD1泛素化水平显著减弱。
(4)对PDK1和Notch1在肿瘤组织中的表达进行相关性分析，分析结果显示PDK1与Notch1的表达呈正相关。免疫荧光实验显示PDK1与NICD1在肿瘤细胞细胞质中共表达。
结论
1.PDK1在下咽癌肿瘤组织中表达上调且与肿瘤恶性进展相关，同时，PDK1高表达患者生存期缩短，提示不良预后。
2.PDK1在体外能促进下咽癌肿瘤细胞的增殖与侵袭转移。
3.PDK1在体内可以促进肿瘤的增殖及远处转移。
4.PDK1通过Notch1信号通路诱导下咽癌肿瘤细胞的EMT并促进肿瘤侵袭转移。
5.PDK1与NICD1在胞质中能够相互结合，进而抑制NICD1泛素化降解，上调NICD1蛋白的表达，从而引起Notch1信号通路的激活，促进下咽癌转移。