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研究背景和目的:
原发性肾病综合征(Primary nephrotic syndrome，PNS)是儿童常见的肾小球疾病。多数患儿对激素治疗反应敏感，病理类型表现为微小病变(Minimal Change Disease，MCD)，预后良好，但部分患儿对激素治疗依赖或抵抗，若不及时给予其他药物干预治疗，可能进展为肾小球硬化，病理类型表现为局灶节段性肾小球硬化(Focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)，最终导致终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)。终末期肾病严重影响患儿的身心健康和生活质量，给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，研究原发性肾病综合征发病及发展至肾小球硬化的机制，尽早进行干预治疗有着极其重要的临床意义。
研究表明，足细胞损伤在PNS发生过程中起着重要作用，足细胞损伤参与了蛋白尿和肾小球硬化的形成。足细胞是位于肾小球基底膜(Glomerular basement membrane，GBM)外侧的终末分化的脏层上皮细胞，对于维持肾小球滤过屏障的结构和功能具有重要意义。既往研究发现，抗荚膜抗体、代谢因素、血液动力学和感染等多种因素可导致足细胞损伤。足细胞损伤可出现细胞凋亡、脱落、增殖抑制，导致肾小球硬化和肾功能损害。在特定条件下，足细胞损伤可导致表型转换，其中足细胞失去上皮细胞标志蛋白质，如P-cadherin和ZO-1，同时获得间充质标志蛋白质，如波形蛋白(Vimentin)和N-cadherin，这个过程被称为足细胞的上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)。近年来研究表明，EMT可使足细胞运动并最终导致这些细胞的精细结构的破坏，从而削弱其滤过屏障功能并导致肾小球硬化。细胞迁移通常被认为是EMT的标志。研究证实，在肾病综合征患者中可以观察到上皮间质转化。HarrisJJ等研究证明，活动性FSGS患者的血浆可显著增加体外足细胞的运动能力。ZhaiS等发现，IL-17通过诱导足细胞凋亡参与原发性肾病综合征患儿的足细胞损伤。但是，有关PNS患儿足细胞损伤的具体机制，尚未得到深入的研究。因此，通过研究足细胞凋亡、增殖、EMT和迁移，来深入探究PNS中足细胞损伤的机制，有助于找寻延缓原发性肾病综合征发生及进展为肾小球硬化的治疗靶点，为精准医学提供依据。
CXC趋化因子配体16(CXC chemokine 16，CXCL16)是一种CXC趋化因子，以跨膜和可溶形式存在，仅与其独特的受体CXCR6结合。越来越多的数据表明CXCL16参与了肾脏疾病。课题组前期研究证明，原发性肾病综合征患儿活动期血清CXCL16水平高于缓解期和正常对照组，血清CXCL16可作为肾病综合征患儿疾病活动的有用指标或生物标志物。然而关于PNS肾组织中CXCL16表达情况及其临床意义国内外报道甚少。CXCL16在足细胞中高表达，可作为ox-LDL的清道夫受体，协助足细胞摄取ox-LDL介导足细胞脂质损伤。另外本课题组通过建立CXCL16基因沉默足细胞模型，发现CXCL16基因沉默后，有脂质聚集引起的足细胞损伤减轻，ROS产生减少，β1整合素表达量增加，发挥细胞保护功能。既往有关CXCL16对足细胞损伤机制研究多为介导足细胞脂质损伤，而我们前期研究发现，经ox-LDL刺激后，足细胞中发生脂质积累且CXCL16的表达水平增加，ox-LDL可通过调节CXCL16表达及调节肌动蛋白细胞骨架来促进足细胞迁移，CXCL16是足细胞迁移和损伤的关键因子。因此，我们推测，CXCL16对儿童PNS中足细胞损伤存在其他作用机制，尚需进一步研究。
细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是有丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPKs)家族的成员，能够广泛参与调节细胞的生长、细胞周期、细胞凋亡和分化过程，是细胞内信号转导的重要信号分子。ERK两种主要亚型ERK1和ERK2是同一基因的两个剪接变体编码的蛋白质，在氨基酸水平上84％相同。ERK1和ERK2信号通路参与许多不同的细胞功能，包括增殖、生长、分化、细胞迁移、细胞存活、代谢和转录等。ERK在肾脏疾病中的作用研究多集中在ERK参与肾癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质化，多种因素可诱导ERK途径参与肾小管上皮细胞上皮间质化，ERK途径参与糖尿病肾病方面。BryanM.Grabias等研究证实，在ERK2蛋白表达的情况下，其下游靶蛋白Snail持续表达，进而促进间充质细胞的标记蛋白N-cadherin和波形蛋白(Vimentin)的持续表达，提示ERK2能够通过调控EMT过程参与肾纤维化。研究发现，糖尿病肾病小鼠中ERK1/2的蛋白表达水平升高，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗可降低其表达水平。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的ERK1/2信号通路的激活在糖尿病肾病足细胞凋亡中起重要作用。有关ERK1/2在原发性肾病综合征足细胞损伤中的作用，国内外研究甚少。ZhangW等研究发现，CXCL16可通过调控ERK1/2诱导肾小管上皮细胞凋亡，抑制增殖，参与急性肾损伤(AKI)。然而，CXCL16是否可通过ERK1/2诱导足细胞凋亡、迁移、EMT及抑制增殖，继而参与原发性肾病综合征足细胞损伤的发生，国内外尚未见报道。
为此，本研究通过观察儿童原发性肾病综合征肾活检组织中CXCL16、ERK1/2的蛋白和mRNA表达水平，比较病理诊断为MCD和FSGS的PNS患儿肾组织中CXCL16、ERK1/2的mRNA表达情况，同时分析儿童PNS肾组织CXCL16mRNA、ERK1/2的mRNA表达与24h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清胆固醇相关性，探讨CXCL16、ERK1/2是否参与儿童PNS的发生发展。同时构建过表达CXCL16、沉默CXCL16、沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的人足细胞(HPC)株，通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移实验以及检测与上皮间质转化密切相关蛋白ZO-1，P-cadherin，Vimentin，N-cadherin的表达，探讨CXCL16是否可通过ERK1/2诱导儿童PNS足细胞损伤及其作用机制，为防治PNS进展至终末肾脏疾病提供理论依据。本研究共分三部分:
第一部分CXCL16与ERK1/2在儿童原发性肾病综合征肾组织中的表达及意义
研究目的:
1.检测CXCL16、ERK1/2在儿童原发性肾病综合征肾组织中的表达。
2.分析CXCL16、ERK1/2的表达与血清白蛋白、血清胆固醇、24h尿蛋白定量相关性，探讨其是否参与PNS的发病。
对象和方法:
1.研究对象与标本采集:收集原发性肾病综合征(PNS)患儿肾组织活检标本15例做为PNS组，收集儿童肾母细胞瘤切除病灶外3cm正常肾组织15例为正常对照组。收集PNS组和正常对照组儿童空腹静脉血3ml。收集PNS组患儿的24h尿液，并准确记录24h总尿量。
2.检测血清白蛋白、血清总胆固醇和24小时尿蛋白定量:在AU5800型全自动生化分析仪上采用溴甲酚绿法测定血清白蛋白(Albumin，Alb)、酶法测定血清总胆固醇(Cholesterol，CHOL)、焦酚红法测定24小时尿蛋白定量(24-hour urine protein，24hUP)。
3.检测CXCL16、ERK1/2在儿童原发性肾病综合征肾组织中的表达:采用免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)、免疫印迹(Western blot，WB)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)进行检测。
4.分析CXCL16、ERK1/2的表达与血清白蛋白、血清总胆固醇、24h尿蛋白定量相关性:将PNS组肾组织中CXCL16、ERK1/2的mRNA表达量与血清白蛋白、血清总胆固醇、24h尿蛋白定量进行相关性分析。
研究结果:
1.免疫组化定量分析结果显示，与正常对照组比较，儿童PNS肾组织中CXCL16的蛋白表达以及ERK1/2的蛋白表达均明显增加，P＜0.001。
2.Westernblot定量分析结果显示，与正常对照组比较，儿童PNS肾组织中CXCL16的蛋白表达以及ERK1/2的蛋白表达均明显增加，P＜0.001。
3.qRT-PCR定量分析结果显示，与正常对照组比较，儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达以及ERK1/2的mRNA表达均明显升高，P＜0.001。
4.与MCD组比较，病理诊断为FSGS的儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达以及ERK1/2的mRNA表达均升高，P＜0.05。
5.相关分析结果显示，儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达以及ERK1/2的mRNA表达与24时小尿蛋白定量成正相关(P值分别为P＜0.001、P＜0.01)，与血清白蛋白成负相关(P值分别为P＜0.01、P＜0.05);儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达与ERK1/2的mRNA表达、血清总胆固醇均成正相关(P值分别为P＜0.05、P＜0.05)。
研究结论:
1.CXCL16、ERK1/2在儿童原发性肾病综合征(PNS)肾组织中表达上调。
2.CXCL16、ERK1/2与24小时尿蛋白定量成正相关，与血清白蛋白成负相关。
3.病理诊断为FSGS的儿童PNS肾组织中CXCL16、ERK1/2的表达较MCD高。
4.CXCL16、ERK1/2可能参与儿童PNS的发生发展。
关键词:PNS;CXCL16;ERK1/2;肾组织;蛋白尿
第二部分CXCL16在足细胞损伤中的作用研究
研究目的:
1.构建过表达CXCL16、沉默CXCL16的人足细胞株。
2.探讨CXCL16在足细胞损伤中的作用。
材料和方法:
1.利用三质粒包装系统包装过表达CXCL16的慢病毒，将包装成功的过表达CXCL16慢病毒滴度液感染HPC细胞，构建稳定过表达CXCL16的HPC细胞株模型。
2.构建沉默CXCL16的慢病毒质粒，构建完成的质粒经过双酶切与测序分析成功后，再利用四质粒包装系统包装沉默CXCL16的慢病毒，将包装成功的沉默CXCL16的慢病毒滴度液分别感染HPC细胞，构建稳定沉默CXCL16的HPC细胞株模型。各细胞株模型中CXCL16的表达情况经qRT-PCR与WB进行验证。
3.通过(Cell counting Kit 8，CCK8)实验，对稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的HPC细胞株进行细胞增殖能力检测。
4.利用流式细胞仪，对稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的HPC细胞株进行细胞凋亡情况检测。
5.通过Transwell小室，对稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的HPC细胞株进行细胞迁移能力检测。
研究结果:
1.经双酶切鉴定、测序结果比对，结果显示，CXCL16shRNA1与CXCL16shRNA2质粒构建成功。
2.Westernblot结果显示，与对照组比较，CXCL16在过表达CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显升高，P＜0.01;与对照组pLKO.1-HPC比较，CXCL16在沉默CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显降低，P＜0.01。
3.qRT-PCR结果显示，与对照组比较，CXCL16在过表达CXCL16的HPC细胞株中的mRNA表达量明显升高，P＜0.001;与对照组pLKO.1-HPC相比，CXCL16在沉默CXCL16的HPC细胞株中的mRNA表达量明显降低，P＜0.05，P＜0.01。
4.利用CCK-8实验结果显示，与对照组比较，过表达CXCL16的足细胞株于接种后第3d、第5d的细胞增殖能力均明显降低，P＜0.01，P＜0.001;与对照组比较，沉默CXCL16的足细胞株于接种后第3d、第5d的细胞增殖能力均明显升高，P＜0.001。
5.利用流式细胞仪检测结果显示，与对照组比较，过表达CXCL16的足细胞株的细胞凋亡率增加，P＜0.05;与对照组比较，沉默CXCL16的足细胞株的细胞凋亡率减低P＜0.05。
6.通过Transwell小室检测结果显示，与对照组比较，过表达CXCL16的足细胞株的细胞迁移能力明显增加，P＜0.001;与对照组比较，沉默CXCL16的足细胞株的细胞迁移能力明显减低，P＜0.01。
研究结论:
1.成功构建稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的人足细胞株模型。
2.过表达CXCL16的足细胞株的细胞增殖能力降低，足细胞凋亡率和迁移能力增加。
3.沉默CXCL16的足细胞株的细胞增殖能力升高，足细胞凋亡率和迁移能力减低。
4.CXCL16通过抑制足细胞增殖、促进足细胞凋亡和迁移参与儿童PNS足细胞损伤。
关键词:CXCL16;PNS;足细胞损伤;增殖;凋亡;迁移
第三部分CXCL16通过调控ERK1/2诱导足细胞损伤机制的研究
研究目的:
1.探讨足细胞中ERK1/2的表达是否受CXCL16的调控。
2.构建沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株模型。
3.探讨ERK1/2在足细胞损伤中的作用。
4.探讨CXCL16是否通过调控ERK1/2来诱导足细胞损伤及其机制。
材料和方法:
1.利用Westernblot实验验证过表达与沉默CXCL16的足细胞中ERK1/2的蛋白表达水平。
2.构建沉默ERK1/2的慢病毒质粒，构建完成的质粒经过双酶切与测序分析成功后，再利用四质粒包装系统包装沉默ERK1/2的慢病毒，将包装成功的沉默ERK1/2的慢病毒滴度液分别感染HPC细胞株和过表达CXCL16的HPC细胞株株，构建沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株模型细胞株模型。各细胞株模型中CXCL16、ERK1/2的表达情况经qRT-PCR与Westernblot实验进行验证。
3.通过(Cell counting Kit 8，CCK8)实验，对沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株进行细胞增殖能力检测。
4.利用流式细胞仪，对沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株进行细胞凋亡情况检测。
5.通过Transwell小室，对沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株进行细胞迁移能力检测。
6.利用Westernblot实验检测沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株中与EMT过程密切相关的ZO-1，P-cadherin，Vimentin和N-cadherin蛋白的表达情况。
研究结果:
1.与对照组比较，CXCL16在过表达CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显升高，P＜0.05，同时ERK1/2的蛋白表达量明显升高，P＜0.01;与对照组比较，CXCL16在沉默CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显降低，P＜0.05，同时ERK1/2的蛋白表达量明显降低，P＜0.01。
2.经双酶切鉴定、测序结果比对，结果显示，ERK1/2shRNA质粒构建成功。
3.Westernblot结果显示，与对照组比较，沉默ERK1/2的HPC细胞株中ERK1/2的蛋白表达量降低，P＜0.05;与对照组比较，过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株中CXCL16的蛋白表达量明显升高，P＜0.001，同时ERK1/2的蛋白表达量明显降低，P＜0.001。
4.qRT-PCR结果显示，与对照组比较，沉默ERK1/2的HPC细胞株中ERK1/2的mRNA表达量降低，P＜0.05;与对照组比较，过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株中ERK1/2的mRNA表达量明显降低，P＜0.01;与对照组比较，过表达CXCL16的HPC细胞株中ERK1/2的mRNA表达量明显升高，P＜0.01。
5.与对照组比较，沉默ERK1/2可使足细胞增殖能力明显升高，P＜0.01;过表达CXCL16可使足细胞增殖能力明显降低，P＜0.001;而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，增殖能力明显升高，P＜0.001。
6.与对照组比较，沉默ERK1/2可使足细胞凋亡率减低，P＜0.05;过表达CXCL16可使足细胞凋亡率明显增加，P＜0.01;而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，细胞凋亡率明显减低，P＜0.001。
7.与对照组比较，沉默ERK1/2可使足细胞迁移能力明显减低，P＜0.01;过表达CXCL16可使足细胞迁移能力明显增加，P＜0.001;而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，细胞迁移能力明显减低，P＜0.001。
8.与对照组比较，沉默ERK1/2的HPC细胞株中ZO-1、P-cadherin蛋白表达升高，Vimentin、N-cadherin蛋白表达降低，P＜0.05;过表达CXCL16的HPC细胞株中ZO-1、P-cadherin蛋白表达降低，Vimentin、N-cadherin蛋白表达升高，P＜0.05。而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，ZO-1、P-cadherin蛋白表达升高，Vimentin、N-cadherin蛋白表达降低，P＜0.05。
研究结论:
1.在足细胞中ERK1/2的蛋白表达和mRNA表达可能受CXCL16的调控。
2.成功构建沉默ERK1/2的HPC细胞株和过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株模型。
3.沉默ERK1/2可使足细胞增殖能力升高，足细胞凋亡率、迁移能力和上皮间质化减低。
4.在过表达CXCL16的足细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达可阻止CXCL16引起的足细胞增殖抑制、足细胞凋亡率和迁移能力增加、上皮间质化增加。
5.CXCL16可通过调控ERK1/2抑制足细胞增殖，促进足细胞凋亡、迁移及EMT，继而参与儿童PNS足细胞损伤的发生。
原发性肾病综合征(Primary nephrotic syndrome，PNS)是儿童常见的肾小球疾病。多数患儿对激素治疗反应敏感，病理类型表现为微小病变(Minimal Change Disease，MCD)，预后良好，但部分患儿对激素治疗依赖或抵抗，若不及时给予其他药物干预治疗，可能进展为肾小球硬化，病理类型表现为局灶节段性肾小球硬化(Focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)，最终导致终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)。终末期肾病严重影响患儿的身心健康和生活质量，给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，研究原发性肾病综合征发病及发展至肾小球硬化的机制，尽早进行干预治疗有着极其重要的临床意义。
研究表明，足细胞损伤在PNS发生过程中起着重要作用，足细胞损伤参与了蛋白尿和肾小球硬化的形成。足细胞是位于肾小球基底膜(Glomerular basement membrane，GBM)外侧的终末分化的脏层上皮细胞，对于维持肾小球滤过屏障的结构和功能具有重要意义。既往研究发现，抗荚膜抗体、代谢因素、血液动力学和感染等多种因素可导致足细胞损伤。足细胞损伤可出现细胞凋亡、脱落、增殖抑制，导致肾小球硬化和肾功能损害。在特定条件下，足细胞损伤可导致表型转换，其中足细胞失去上皮细胞标志蛋白质，如P-cadherin和ZO-1，同时获得间充质标志蛋白质，如波形蛋白(Vimentin)和N-cadherin，这个过程被称为足细胞的上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)。近年来研究表明，EMT可使足细胞运动并最终导致这些细胞的精细结构的破坏，从而削弱其滤过屏障功能并导致肾小球硬化。细胞迁移通常被认为是EMT的标志。研究证实，在肾病综合征患者中可以观察到上皮间质转化。HarrisJJ等研究证明，活动性FSGS患者的血浆可显著增加体外足细胞的运动能力。ZhaiS等发现，IL-17通过诱导足细胞凋亡参与原发性肾病综合征患儿的足细胞损伤。但是，有关PNS患儿足细胞损伤的具体机制，尚未得到深入的研究。因此，通过研究足细胞凋亡、增殖、EMT和迁移，来深入探究PNS中足细胞损伤的机制，有助于找寻延缓原发性肾病综合征发生及进展为肾小球硬化的治疗靶点，为精准医学提供依据。
CXC趋化因子配体16(CXC chemokine 16，CXCL16)是一种CXC趋化因子，以跨膜和可溶形式存在，仅与其独特的受体CXCR6结合。越来越多的数据表明CXCL16参与了肾脏疾病。课题组前期研究证明，原发性肾病综合征患儿活动期血清CXCL16水平高于缓解期和正常对照组，血清CXCL16可作为肾病综合征患儿疾病活动的有用指标或生物标志物。然而关于PNS肾组织中CXCL16表达情况及其临床意义国内外报道甚少。CXCL16在足细胞中高表达，可作为ox-LDL的清道夫受体，协助足细胞摄取ox-LDL介导足细胞脂质损伤。另外本课题组通过建立CXCL16基因沉默足细胞模型，发现CXCL16基因沉默后，有脂质聚集引起的足细胞损伤减轻，ROS产生减少，β1整合素表达量增加，发挥细胞保护功能。既往有关CXCL16对足细胞损伤机制研究多为介导足细胞脂质损伤，而我们前期研究发现，经ox-LDL刺激后，足细胞中发生脂质积累且CXCL16的表达水平增加，ox-LDL可通过调节CXCL16表达及调节肌动蛋白细胞骨架来促进足细胞迁移，CXCL16是足细胞迁移和损伤的关键因子。因此，我们推测，CXCL16对儿童PNS中足细胞损伤存在其他作用机制，尚需进一步研究。
细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是有丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPKs)家族的成员，能够广泛参与调节细胞的生长、细胞周期、细胞凋亡和分化过程，是细胞内信号转导的重要信号分子。ERK两种主要亚型ERK1和ERK2是同一基因的两个剪接变体编码的蛋白质，在氨基酸水平上84％相同。ERK1和ERK2信号通路参与许多不同的细胞功能，包括增殖、生长、分化、细胞迁移、细胞存活、代谢和转录等。ERK在肾脏疾病中的作用研究多集中在ERK参与肾癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质化，多种因素可诱导ERK途径参与肾小管上皮细胞上皮间质化，ERK途径参与糖尿病肾病方面。BryanM.Grabias等研究证实，在ERK2蛋白表达的情况下，其下游靶蛋白Snail持续表达，进而促进间充质细胞的标记蛋白N-cadherin和波形蛋白(Vimentin)的持续表达，提示ERK2能够通过调控EMT过程参与肾纤维化。研究发现，糖尿病肾病小鼠中ERK1/2的蛋白表达水平升高，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗可降低其表达水平。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的ERK1/2信号通路的激活在糖尿病肾病足细胞凋亡中起重要作用。有关ERK1/2在原发性肾病综合征足细胞损伤中的作用，国内外研究甚少。ZhangW等研究发现，CXCL16可通过调控ERK1/2诱导肾小管上皮细胞凋亡，抑制增殖，参与急性肾损伤(AKI)。然而，CXCL16是否可通过ERK1/2诱导足细胞凋亡、迁移、EMT及抑制增殖，继而参与原发性肾病综合征足细胞损伤的发生，国内外尚未见报道。
为此，本研究通过观察儿童原发性肾病综合征肾活检组织中CXCL16、ERK1/2的蛋白和mRNA表达水平，比较病理诊断为MCD和FSGS的PNS患儿肾组织中CXCL16、ERK1/2的mRNA表达情况，同时分析儿童PNS肾组织CXCL16mRNA、ERK1/2的mRNA表达与24h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清胆固醇相关性，探讨CXCL16、ERK1/2是否参与儿童PNS的发生发展。同时构建过表达CXCL16、沉默CXCL16、沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的人足细胞(HPC)株，通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移实验以及检测与上皮间质转化密切相关蛋白ZO-1，P-cadherin，Vimentin，N-cadherin的表达，探讨CXCL16是否可通过ERK1/2诱导儿童PNS足细胞损伤及其作用机制，为防治PNS进展至终末肾脏疾病提供理论依据。本研究共分三部分:
第一部分CXCL16与ERK1/2在儿童原发性肾病综合征肾组织中的表达及意义
研究目的:
1.检测CXCL16、ERK1/2在儿童原发性肾病综合征肾组织中的表达。
2.分析CXCL16、ERK1/2的表达与血清白蛋白、血清胆固醇、24h尿蛋白定量相关性，探讨其是否参与PNS的发病。
对象和方法:
1.研究对象与标本采集:收集原发性肾病综合征(PNS)患儿肾组织活检标本15例做为PNS组，收集儿童肾母细胞瘤切除病灶外3cm正常肾组织15例为正常对照组。收集PNS组和正常对照组儿童空腹静脉血3ml。收集PNS组患儿的24h尿液，并准确记录24h总尿量。
2.检测血清白蛋白、血清总胆固醇和24小时尿蛋白定量:在AU5800型全自动生化分析仪上采用溴甲酚绿法测定血清白蛋白(Albumin，Alb)、酶法测定血清总胆固醇(Cholesterol，CHOL)、焦酚红法测定24小时尿蛋白定量(24-hour urine protein，24hUP)。
3.检测CXCL16、ERK1/2在儿童原发性肾病综合征肾组织中的表达:采用免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)、免疫印迹(Western blot，WB)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)进行检测。
4.分析CXCL16、ERK1/2的表达与血清白蛋白、血清总胆固醇、24h尿蛋白定量相关性:将PNS组肾组织中CXCL16、ERK1/2的mRNA表达量与血清白蛋白、血清总胆固醇、24h尿蛋白定量进行相关性分析。
研究结果:
1.免疫组化定量分析结果显示，与正常对照组比较，儿童PNS肾组织中CXCL16的蛋白表达以及ERK1/2的蛋白表达均明显增加，P＜0.001。
2.Westernblot定量分析结果显示，与正常对照组比较，儿童PNS肾组织中CXCL16的蛋白表达以及ERK1/2的蛋白表达均明显增加，P＜0.001。
3.qRT-PCR定量分析结果显示，与正常对照组比较，儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达以及ERK1/2的mRNA表达均明显升高，P＜0.001。
4.与MCD组比较，病理诊断为FSGS的儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达以及ERK1/2的mRNA表达均升高，P＜0.05。
5.相关分析结果显示，儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达以及ERK1/2的mRNA表达与24时小尿蛋白定量成正相关(P值分别为P＜0.001、P＜0.01)，与血清白蛋白成负相关(P值分别为P＜0.01、P＜0.05);儿童PNS肾组织中CXCL16的mRNA表达与ERK1/2的mRNA表达、血清总胆固醇均成正相关(P值分别为P＜0.05、P＜0.05)。
研究结论:
1.CXCL16、ERK1/2在儿童原发性肾病综合征(PNS)肾组织中表达上调。
2.CXCL16、ERK1/2与24小时尿蛋白定量成正相关，与血清白蛋白成负相关。
3.病理诊断为FSGS的儿童PNS肾组织中CXCL16、ERK1/2的表达较MCD高。
4.CXCL16、ERK1/2可能参与儿童PNS的发生发展。
关键词:PNS;CXCL16;ERK1/2;肾组织;蛋白尿
第二部分CXCL16在足细胞损伤中的作用研究
研究目的:
1.构建过表达CXCL16、沉默CXCL16的人足细胞株。
2.探讨CXCL16在足细胞损伤中的作用。
材料和方法:
1.利用三质粒包装系统包装过表达CXCL16的慢病毒，将包装成功的过表达CXCL16慢病毒滴度液感染HPC细胞，构建稳定过表达CXCL16的HPC细胞株模型。
2.构建沉默CXCL16的慢病毒质粒，构建完成的质粒经过双酶切与测序分析成功后，再利用四质粒包装系统包装沉默CXCL16的慢病毒，将包装成功的沉默CXCL16的慢病毒滴度液分别感染HPC细胞，构建稳定沉默CXCL16的HPC细胞株模型。各细胞株模型中CXCL16的表达情况经qRT-PCR与WB进行验证。
3.通过(Cell counting Kit 8，CCK8)实验，对稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的HPC细胞株进行细胞增殖能力检测。
4.利用流式细胞仪，对稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的HPC细胞株进行细胞凋亡情况检测。
5.通过Transwell小室，对稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的HPC细胞株进行细胞迁移能力检测。
研究结果:
1.经双酶切鉴定、测序结果比对，结果显示，CXCL16shRNA1与CXCL16shRNA2质粒构建成功。
2.Westernblot结果显示，与对照组比较，CXCL16在过表达CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显升高，P＜0.01;与对照组pLKO.1-HPC比较，CXCL16在沉默CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显降低，P＜0.01。
3.qRT-PCR结果显示，与对照组比较，CXCL16在过表达CXCL16的HPC细胞株中的mRNA表达量明显升高，P＜0.001;与对照组pLKO.1-HPC相比，CXCL16在沉默CXCL16的HPC细胞株中的mRNA表达量明显降低，P＜0.05，P＜0.01。
4.利用CCK-8实验结果显示，与对照组比较，过表达CXCL16的足细胞株于接种后第3d、第5d的细胞增殖能力均明显降低，P＜0.01，P＜0.001;与对照组比较，沉默CXCL16的足细胞株于接种后第3d、第5d的细胞增殖能力均明显升高，P＜0.001。
5.利用流式细胞仪检测结果显示，与对照组比较，过表达CXCL16的足细胞株的细胞凋亡率增加，P＜0.05;与对照组比较，沉默CXCL16的足细胞株的细胞凋亡率减低P＜0.05。
6.通过Transwell小室检测结果显示，与对照组比较，过表达CXCL16的足细胞株的细胞迁移能力明显增加，P＜0.001;与对照组比较，沉默CXCL16的足细胞株的细胞迁移能力明显减低，P＜0.01。
研究结论:
1.成功构建稳定过表达CXCL16、沉默CXCL16的人足细胞株模型。
2.过表达CXCL16的足细胞株的细胞增殖能力降低，足细胞凋亡率和迁移能力增加。
3.沉默CXCL16的足细胞株的细胞增殖能力升高，足细胞凋亡率和迁移能力减低。
4.CXCL16通过抑制足细胞增殖、促进足细胞凋亡和迁移参与儿童PNS足细胞损伤。
关键词:CXCL16;PNS;足细胞损伤;增殖;凋亡;迁移
第三部分CXCL16通过调控ERK1/2诱导足细胞损伤机制的研究
研究目的:
1.探讨足细胞中ERK1/2的表达是否受CXCL16的调控。
2.构建沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株模型。
3.探讨ERK1/2在足细胞损伤中的作用。
4.探讨CXCL16是否通过调控ERK1/2来诱导足细胞损伤及其机制。
材料和方法:
1.利用Westernblot实验验证过表达与沉默CXCL16的足细胞中ERK1/2的蛋白表达水平。
2.构建沉默ERK1/2的慢病毒质粒，构建完成的质粒经过双酶切与测序分析成功后，再利用四质粒包装系统包装沉默ERK1/2的慢病毒，将包装成功的沉默ERK1/2的慢病毒滴度液分别感染HPC细胞株和过表达CXCL16的HPC细胞株株，构建沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株模型细胞株模型。各细胞株模型中CXCL16、ERK1/2的表达情况经qRT-PCR与Westernblot实验进行验证。
3.通过(Cell counting Kit 8，CCK8)实验，对沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株进行细胞增殖能力检测。
4.利用流式细胞仪，对沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株进行细胞凋亡情况检测。
5.通过Transwell小室，对沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株进行细胞迁移能力检测。
6.利用Westernblot实验检测沉默ERK1/2、过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株中与EMT过程密切相关的ZO-1，P-cadherin，Vimentin和N-cadherin蛋白的表达情况。
研究结果:
1.与对照组比较，CXCL16在过表达CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显升高，P＜0.05，同时ERK1/2的蛋白表达量明显升高，P＜0.01;与对照组比较，CXCL16在沉默CXCL16的HPC细胞株中的蛋白表达量明显降低，P＜0.05，同时ERK1/2的蛋白表达量明显降低，P＜0.01。
2.经双酶切鉴定、测序结果比对，结果显示，ERK1/2shRNA质粒构建成功。
3.Westernblot结果显示，与对照组比较，沉默ERK1/2的HPC细胞株中ERK1/2的蛋白表达量降低，P＜0.05;与对照组比较，过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株中CXCL16的蛋白表达量明显升高，P＜0.001，同时ERK1/2的蛋白表达量明显降低，P＜0.001。
4.qRT-PCR结果显示，与对照组比较，沉默ERK1/2的HPC细胞株中ERK1/2的mRNA表达量降低，P＜0.05;与对照组比较，过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株中ERK1/2的mRNA表达量明显降低，P＜0.01;与对照组比较，过表达CXCL16的HPC细胞株中ERK1/2的mRNA表达量明显升高，P＜0.01。
5.与对照组比较，沉默ERK1/2可使足细胞增殖能力明显升高，P＜0.01;过表达CXCL16可使足细胞增殖能力明显降低，P＜0.001;而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，增殖能力明显升高，P＜0.001。
6.与对照组比较，沉默ERK1/2可使足细胞凋亡率减低，P＜0.05;过表达CXCL16可使足细胞凋亡率明显增加，P＜0.01;而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，细胞凋亡率明显减低，P＜0.001。
7.与对照组比较，沉默ERK1/2可使足细胞迁移能力明显减低，P＜0.01;过表达CXCL16可使足细胞迁移能力明显增加，P＜0.001;而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，细胞迁移能力明显减低，P＜0.001。
8.与对照组比较，沉默ERK1/2的HPC细胞株中ZO-1、P-cadherin蛋白表达升高，Vimentin、N-cadherin蛋白表达降低，P＜0.05;过表达CXCL16的HPC细胞株中ZO-1、P-cadherin蛋白表达降低，Vimentin、N-cadherin蛋白表达升高，P＜0.05。而在过表达CXCL16的HPC细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达，与单独过表达CXCL16的HPC组比较，ZO-1、P-cadherin蛋白表达升高，Vimentin、N-cadherin蛋白表达降低，P＜0.05。
研究结论:
1.在足细胞中ERK1/2的蛋白表达和mRNA表达可能受CXCL16的调控。
2.成功构建沉默ERK1/2的HPC细胞株和过表达CXCL16且沉默ERK1/2的HPC细胞株模型。
3.沉默ERK1/2可使足细胞增殖能力升高，足细胞凋亡率、迁移能力和上皮间质化减低。
4.在过表达CXCL16的足细胞株中进一步敲低ERK1/2的表达可阻止CXCL16引起的足细胞增殖抑制、足细胞凋亡率和迁移能力增加、上皮间质化增加。
5.CXCL16可通过调控ERK1/2抑制足细胞增殖，促进足细胞凋亡、迁移及EMT，继而参与儿童PNS足细胞损伤的发生。