论文部分内容阅读
Toll样受体作为一种重要的模式识别受体,能够识别多种病原相关分子模式。大量研究报道表明,禽类的TLR3、TLR7与TLR21参与机体的抗病毒免疫反应。水禽鹅,作为许多病原的天然宿主,其抗病毒免疫反应值得做深入研究。本研究首次对鹅TLR7 (GoTLR7)与鹅TLR21 (GoTLR21)的抗病毒免疫学特性进行研究。通过使用低致病性禽流感病毒(H9N2)与鹅细小病毒(GPV)对3日龄雏鹅进行人工感染,检测其主要免疫器官及其他相关器官发现：在感染H9N2病毒后的第3天到第7天,GoTLR7在肺组织的相对表达量显著高于对照组,特别是在第7天其表达量上调了约5倍,但在第一天实验组与对照组无显著差异；在小肠组织中,两组之间GoTLR21与GoTLR7表达量均无显著差异。RIG-I受体作为另外一种非常重要的模式识别受体,负责识别病毒的特定RNA。在H9N2感染第3天鹅的肺和小肠组织中GoRIG-I表达量显著高于对照组。在H9N2感染过程中,干扰素诱导小分子(MX,OAS, PKR)表现出不同的变化规律：MX在所有组织中均无显著变化；OAS在法氏囊、哈氏腺与肺组织的表达量显著高于对照组；PKR在肺组织表达量显著上调,但其在胸腺组织显著下调。GPV感染雏鹅后：GoTLR7在所有组织均无显著变化；GoTLR21在脾脏和胸腺显著升高,而在其他组织并无显著变化；干扰素诱导的抗病毒小分子OAS在小肠组织表达量显著高于对照组,而在其他组织无显著变化；GoRIG-I、GoMX与GoPKR在各组织的相对表达量与对照组相比均无显著差异。因此,结果表明GoTLR7与GoRIG-I参与宿主的抗H9N2流感病毒感染的免疫反应,并诱导抗病毒小分子的产生。GoTLR21参与宿主抗GPV病毒感染的免疫反应,诱导抗病毒小分子的产生。此外,我们还建立了体外感染模型,分别使用H9N2与GPV刺激鹅外周血单核细胞。用定量RT-PCR的方法检测H9N2感染8h时GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游调控干扰素诱导小分子MX、OAS与PKR水平,结果显示：实验组GoTLR7与GoRIG-I的表达量显著性升高,而GoTLR21无任何变化；干扰素诱导小分子MX呈现显著下降,而OAS与PKR均表现出显著上升。用定量RT-PCR的方法检测GPV感染8h时GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游调控干扰素诱导小分子MX、OAS与PKR水平,结果显示：GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游调控MX、OAS与PKR转录水平与对照组相比均无显著差异。结果表明GoTLR7与GoRIG-I在体外参与了抗H9N2流感病毒感染的免疫反应,并诱导抗病毒小分子的产生。GPV感染PBMC后,GoTLR21与其他免疫相关基因均无显著性变化,我们猜测可能是由于GPV病毒需要更长的时间才能引起TLR21受体的识别,从而产生抗病毒因子,本实验作用时间为8小时不能有效的诱导宿主经由TLR21的抗病毒反应。为了进一步探讨GoTLR7与GoTLR21是否具有抗病毒免疫学活性,我们构建了真核表达质粒PEGFP-C1-GoTLR7与pDs-Red1-N1-GoTLR21并转染传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)10h,然后孵育新城疫病毒(New castle disease virus, NDV),经绝对定量PCR反应及病毒滴度检测而观察转染GoTLR7与GoTLR21质粒是否对DF-1细胞中NDV的增殖或复制存在影响。GoTLR7与GoTLR21真核表达质粒分别转染DF-1细胞,而后孵育NDV病毒,研究结果显示：孵育NDV病毒12h后转染有GoTLR7细胞中NDV的复制受到显著的抑制,而转染GoTLR21并未对病毒增殖造成影响；孵育NDV病毒24h时,实验组与对照组的病毒拷贝数均有所上升,但是转染GoTLR7组中NDV拷贝数及TCIDso数值均显著低于对照组,而转染GoTLR21组中病毒增殖情况与对照组比较仍无显著差异。因此,本实验再次验证GoTLR7参与抗RNA病毒免疫反应,并能抑制RNA病毒NDV的复制,而GoTLR21并不参与此反应。大量研究表明哺乳动物抗病毒TLR分布于细胞内的核内体。为了验证禽类抗病毒TLR的细胞分布,我们将真核表达质粒PEGFP-C1-GoTLR7分别转染DF-1、GEF与BHK21。24h后对细胞核进行染色发现GoTLR7在DF-1、BHK21与GEF上的细胞定位不同,具体表现为：DF-1和BHK21细胞中GoTLR7荧光信号集中分布于细胞核一侧,呈现极化状态；而GEF细胞上GoTLR7荧光信号围绕分布于细胞核周围,非分布于细胞核一侧。我们分别采集PEGFP-C1-GoTLR7转染BHK21细胞24h、48h与72h时的图片发现：GoTLR7的细胞定位随表达时间发生了变化,具体表现为：24h时,GoTLR7分布于细胞核的一侧,而在48h及72h, GoTLR7绿色荧光集中分布于远离细胞核的胞质内,呈现球形,推测其定位于某细胞器。将真核表达质粒pDs-Redl-N1-GoTLR21分别转染DF-1、GEF、MDCK与BHK21。24h后对细胞进行染色,发现在不同细胞类型上GoTLR21分布特征一致,均表现为紧紧围绕于细胞核周围。分别采集pDs-Red1-N1-GoTLR21转染BHK21 24h、48h与72h的图片发现,GoTLR21的细胞定位随表达时间也发生了变化。具体表现为：转染24h时,GoTLR21红色荧光表现为紧紧围绕细胞核周围,呈现圆圈状特征,而在48h时发现其浓缩为圆点状,且远离细胞核分布,到72h时其形状再次变为环形。因此,我们推测GoTLR7与GoTLR21也定位于细胞内的细胞器上,内质网或者核内体上。综上,本研究为鹅抗病毒TLR的抗病毒免疫学特性及生物学功能研究奠定基础,为研发新型佐剂及抗病毒生物制剂提供理论基础。