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正常肝脏在各种慢性肝病损伤下,引起持续或反复的肝实质炎症坏死,使得纤维结缔组织大量增生,而其降解相对不足,大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积形成肝纤维化,进一步进展则导致肝硬化的发生。如果能给予有效的治疗,则已经形成的肝纤维化可以逆转。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)由静息态被激活是肝纤维化的关键环节和细胞学基础,活化的HSC能合成和分泌ECM,导致ECM在肝内过量沉积。
转化生长因子pi(transforming growth factor beta l,TGFpi)能够促进HSC转变为肌成纤维样细胞,增加细胞外基质的产生,减少基质的降减,并抑制肝细胞再生及诱导凋亡,在肝纤维化的发生中起到重要作用,被认为是目前最强的致纤维化因子。
胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白l(insulin-like growth factor binding protein related protein 1,IGFBPrPI)是一种可溶性的分泌性蛋白质。导师刘立新前期研究发现,IGFBPrPI在肝纤维化和肝硬化患者肝组织中高表达,并且与TGFpi的高表达和胶原合成的增多呈正相关:外源性重组TGFpi作用于体外培养的HSC后,可使IGFBPrPI蛋白的产生增多;抗IGFBPrPI抗体可以抑制TAA诱导的肝纤维化小鼠肝组织中TGFpi的产生。有研究表明,0.05-O.lμg/L浓度的外源性重组TGFβ1作用于兔角膜内皮细胞时,可以促进细胞的增殖,内源性TGFpi基因在兔角膜内皮细胞中过表达后,细胞增殖受到抑制,提示不同来源的TGFβ1对同一细胞的生理作用会有不同的影响。为了明确内源性TGFβ1对肝星状细胞中IGFBPrPI表达的影响及其可能的意义,设计了本课题。
目的：
明确内源性转化生长因子(TGF)βl对肝星状细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白I(IGFBPrPI)表达的影响及其可能的意义。
方法：
1.转染效率检测
使用带荧光的阴性质粒pEGFP-NI转染人肝星状细胞LX-2后48h,荧光显微镜下观察转染效率。
2.内源性TGFpi基因过表达
将LX-2分为3组:空白对照组:加入等量不含血清及抗生素的RPMl-1640培养液;阴性质粒组:转染阴性对照质粒;TGFpi过表达组:转染TGFβl过表达质粒。转染后不同时间(24h、48h、72h),采用Real-timePCR法检测TGFβl、CollagenImRNA的表达;转染后72h,采用Westemblot法检测细胞上清液中TGFβl、CollagenI蛋白的表达。
3.内源性TGFpi对IGFBPrP1表达的影响
LX-2分组及处理同前,转染后不同时间(24h、48h、72h),采用Real-time PCR法检测IGFBPrPImRNA的表达;转染后72h,采用Western blot法检测细胞胞浆中IGFBPrPI蛋白的表达。
结果：
1.细胞转染效率
转染后48h,荧光显微镜下观察,可见绿色荧光,说明转染成功,计算质粒转染效率达40％。
2.TGFpi、Collagenl mRNA及蛋白的表达
Real-time PCR检测结果显示:转染后24h,TGFβl过表达组(32.22±0.39)TGFpl mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(7.98±0.12),差异有统计学意义(P＜O.OI),TGFpi过表达组(1.92±0.04)CollagenI mRNA的表达与阴性质粒组(1.99±0.07)差别不明显（P＞0.05）;转染后48h,TGFβ1过表达组(63.12+0.44)TGFpi mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(l.Ol±0.01),TGFpi过表达组(2.00±0.06)CollagenI mRNA的表达显著高于空白对照组(l)及阴性质粒组(1.02±0.01),差异均有统计学意义（P值均＜0.01）;转染后72h,TGFpi过表达组(38.46±0.19)TGFpi mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.05±0.01),TGFpi过表达组(8.63+0.15)CollagenI mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组(1.03±0.02),差异均有统计学意义(P值均＜0.01)。Western blot检测结果显示:转染后72h,TGFβl过表达组(0.27±0.04)TGFpi蛋白的表达明显高于空白对照组(0.20βO.OI)及阴性质粒组(0.22β0.01),TGFpi过表达组(1.47±0.02)CollagenI蛋白的表达明显高于空白对照组(0.76±0.03)及阴性质粒组(0.77±0.02),差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。
3.IGFBPrPI mRNA及蛋白的表达
Real-time PCR检测结果显示:转染后24h,TGFpi过表达组(4.33±0.38)IGFBPrPI mRNA的表达显著高于空白对照组(l)及阴性质粒组（2.86±0.09）;转染后48h,TGFpi过表达组(1.4l±O.11)IGFBPrPI mRNA的表达显著高于空白对照组(1)及阴性质粒组（1.07±0.16）;转染后72h,TGFβl过表达组(2.56±0.30)IGFBPrPI mRNA的表达显著高于空白对照组(l)及阴性质粒组(l.Oo±0.10),差异均有统计学意义(P值均＜0.Ol)。Western blot检测结果显示:转染后72h,TGFpi过表达组(0.53±O.OI)IGFBPrPI蛋白的表达明显高于空白对照组(0.25±0.02)及阴性质粒组(0.27±0.03),差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：
内源性TGFpi可引起LX-2过表达TGFβl和CollagenI mRNA及蛋白,同时亦可以增加IGFBPrPI mRNA及蛋白的表达。推测IGFBPrPI与致肝纤维化最强的因子TGFβl之间密切相关,在肝纤维化的发生发展中起重要作用。