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桑树不仅是家蚕的饲料树种,也是蚕丝产业的重要物质基础。桑树除可供采叶养蚕外,还具有很高的食用、药用、饲用和生态价值。桑树在生长发育过程中经常会受到一些病原微生物的侵染,严重影响蚕业生产发展以及桑树生态和经济价值的实现。发掘桑树抗病基因,利用基因工程技术培育抗病桑树新品种,有利于充分发挥桑树的经济和生态作用。应激响应A/B桶结构域蛋白HS1基因作为一类应激响应基因与植物的系统获得性抗性密切相关,但其具体的生物功能和作用机制还不清楚。本研究根据获得的桑树转录组信息,克隆得到了桑树应激响应A/B桶结构域蛋白HS1基因Mul-HS1,并对其生物学功能进行了研究;同时扩增了Mul-HS1基因的启动子,对其诱导表达活性进行了分析,探讨了Mul-HS1基因的表达调控方式。研究结果可望为桑树抗病育种提供候选基因,同时也为应激响应A/B桶结构域蛋白HS1基因功能和作用机制的研究奠定了基础。本研究主要结果如下:(1)桑树应激响应A/B桶结构域蛋白HS1基因Mul-HS1的功能本研究克隆了桑树应激响应A/B桶结构域蛋白HS1基因(Mul-HS1),该基因编码的蛋白质包含有110个氨基酸,理论分子质量为12.5 kDa,等电点为5.45。Mul-HS1蛋白质为具有较多疏水氨基酸及带电氨基酸的疏水蛋白质,其二级结构中富含α-螺旋和无规则卷曲,其次还有少量的延伸片段和β-折叠;该蛋白质不具有信号肽和跨膜结构,但具有多个翻译后修饰位点;Mul-HS1蛋白质与其它物种同源蛋白质的氨基酸序列一致性较高,该蛋白质的氨基酸序列具有较高的保守性;Mul-HS1蛋白质与多个病程相关蛋白及应激响应相关蛋白存在互作关系;将克隆得到的Mul-HS1基因插入到表达载体pBI121中,构建了pBI121-Mul-HS1植物表达载体,并获得了转基因植株,发现Mul-HS1基因在拟南芥中超表达可以增强转基因植株对细菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst.DC3000)、真菌灰霉菌及卵菌辣椒疫霉菌的抗性。表明Mul-HS1基因在提高植物对病原细菌、真菌和卵菌的抗性方面具有一定作用。(2)Mul-HS1基因的组织表达特性和Mul-HS1蛋白质的亚细胞定位分析荧光定量PCR分析发现Mul-HS1在桑树不同组织中的表达丰度存在明显差异,其中在雄花中表达量最高,其次是茎、成熟桑椹和雌花中,在叶和未成熟桑椹中的表达量相对较低;将Mul-HS1基因插入到pROKⅡ-GFP表达载体中,构建了Mul-HS1-GFP融合基因植物表达载体,转化农杆菌GV3101,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达系统结合显微观察,证明了Mul-HS1蛋白质主要定位于细胞质和细胞核中。(3)Mul-HS1基因启动子的克隆及其表达活性分析克隆得到了Mul-HS1基因启动子,命名为pMul-HS1,发现该启动子核苷酸序列包含有启动子的核心元件以及多种环境因子响应元件,表明Mul-HS1可能通过不同的信号通路参与植物对外界胁迫的响应过程。利用烟草叶片瞬时表达体系联合GUS组织化学染色法对启动子pMul-HS1的表达活性进行了分析,发现pMul-HS1具有病原菌Pst.DC3000、灰霉菌、辣椒疫霉菌,激素水杨酸、茉莉酸、脱落酸以及光照、低温等诱导表达活性。