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现阶段，临床上对于终末期肝脏疾病最有效且常用的治疗手段，是肝脏切除和肝移植手术，而肝脏缺血再灌注损伤是在肝脏切除和肝移植手术过程中常见的且不可避免的并发症。干细胞因其具有强大的自我复制能力和体外多向分化潜能，干细胞移植在缺血再灌注损伤的实验研究中应用甚广。以往研究已证实，哺乳动物骨髓来源的干细胞在生理或病理情况下都具有很强的迁移与分化能力，在体外经过特定的条件培养可分化为多个胚层来源的细胞，如类肝样细胞、成神经细胞、成脂细胞、成骨细胞等，且干细胞移植治疗有利于组织损伤修复及功能的恢复，是组织修复工程较为理想的种子细胞，是一种临床上很有发展前景的治疗策略。但如何可以对移植入缺血再灌注损伤肝脏内的干细胞进行活体监测？那么就需要分子成像技术的支持。
影像技术的进步和成像试剂的创新，使分子成像技术得到了快速发展。在分子成像领域，通过分子生物学和影像技术的结合，使在分子或细胞水平上进行研究和诊断的能力得到了飞速提升。医学分子成像技术有许多成像设备，如US、CT、MRI、OI、PET、SPECT等，这些分子影像设备在成像灵敏度、空间和时间分辨率等性能方面都有各自的优缺点，它们可以为临床工作人员及基础研究人员提供人或动物细胞甚至分子水平的信息，也能够提供从形态结构到功能代谢等方面的详细信息。这些成像技术的联合使用，可以弥补单独使用某一种成像方法的不足。比如，在动物实验研究中，多种分子影像设备（如MRI）在无需处死实验动物的情况下即可实现对动物的长期非侵入性的观察，但是，其空间分辨率以及信噪比(Signal-to-noise ratio，SNR)存在一定的不足。因此，常常需要通过使用对比剂或分子影像探针，或结合其他影像学检查方法进行双/多模态成像来改进空间分辨率和SNR。理论上，双模态和多模态医学检查仅需要使用一种探针，而且，通过这种多模式成像可以获得更准确和完整的信息，帮助临床医生早期发现疾病，改善诊断和进行疗效评估。目前，双模态和多模态医学影像方法越来越多的应用于小动物的分子成像研究，双模态和多模态对比剂也广泛应用于标记移植细胞的动物体内示踪。
本课题以荧光及MR双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓来源的间充质干细胞，由于MR检查序列中的T2WI序列可对顺磁性物质标记的细胞进行体内示踪，显示为低信号区，因此可以对Molday IONTM EverGreen标记的大鼠骨髓来源的间充质干细胞进行体内外检测示踪，同时研究其对同种异体移植大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的抗损伤、抗凋亡、促修复的作用。
目前，随着医学影像技术后处理应用研究技术的发展，磁共振(Magnetic resonance imaging，MRI)成像技术不仅可以利用MR非侵袭性的方法观测到活体组织中细胞的迁移和增殖状况，而且可以通过定量或半定量后处理分析软件对细胞移植后的器官功能、血流动力学变化进行评价，对于评估干细胞移植的效果有重要意义，本研究采用动态增强(Dynamic contrast-enhanced，DCE)MRI扫描方法结合定量后处理软件分析大鼠肝脏缺血再灌注损伤区域肝组织微血管的血流动力学参数，为干细胞体内移植治疗肝脏缺血再灌注损伤提供了帮助。研究共分为以下两个部分。
第一部分 双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓间充质干细胞及体外MR成像研究
目的：
骨髓间充质干细胞在体外一定条件诱导下具有多向分化的能力，因此，在组织工程研究中成为使用越来越广泛的种子细胞。若想借助医学影像设备深入研究BMSCs在体内的分布、增殖情况及其对器官功能的影响，首先必须要解决如何能安全、高效地使用影像显影剂标记BMSCs的问题。本文采用荧光和磁性双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓来源间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)，探讨Molday IONTM EverGreen标记BMSCs的适宜标记浓度及其标记BMSCs6周以内不同时间点的细胞活力和标记率;初探Molday IONTM EverGreen标记BMSCs进行体外MR成像的可行性，为进一步研究BMSCs移植后的活体示踪提供实验依据。
方法：
分离、培养、传代大鼠BMSCs后，使用三种浓度的（铁浓度为10、20、50μg/ml）Molday IONTM EverGreen对第三代BMSCs进行荧光及磁性双标记，通过普鲁士蓝染色观察细胞铁标记率、荧光镜观察细胞的荧光标记率，比较三种浓度Molday IONTM EverGreen标记BMSCs的阳性标记率;观察20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天及1周、2周、4周、6周细胞的荧光标记率。台盼蓝拒染法检测20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天及1周、2周、3周、4周、5周、6周的细胞活力。使用荧光染料HOECHST33342/PI双染Molday IONTM EverGreen-BMSCs细胞核后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察三种浓度Molday IONTM EverGreen（铁浓度为10、20、50μg/ml）标记BMSCs的存活率。应用3.0T MR扫描仪对不同浓度Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs行T1、T2序列扫描，确定Molday IONTM EverGreen标记BMSCs的最佳标记浓度。
结果：
BMSCs原代早期细胞呈圆形、三角形、多角形，少数呈梭形，原代晚期呈梭形居多，体外传至第二代培养1周即可达到80％左右的细胞融合，形态上呈比原代细胞更为均匀的长梭形;体外传至第三代，BMSCs基本纯化，经细胞鉴定（免疫荧光检测鉴定法）细胞表面标记物CD29(+)、CD34(-)、CD44(+)、CD45(-)。三种浓度Molday IONTM EverGreen（铁浓度为10、20、50μg/ml）标记BMSCs后经普鲁士蓝染色和荧光镜观察标记率均接近100％，而对照组（无Molday IONTM EverGreen标记）标记率为零。普鲁士蓝染色显示Molday IONTM EverGreen-BMSCs胞质内蓝染的铁颗粒，且随Molday IONTM EverGreen标记浓度增加，蓝染物质增多、颜色加深。三种浓度Molday IONTM EverGreen的细胞荧光标记率均接近100％，但10μg/ml Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs细胞质的荧光强度欠佳，而50μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后培养16h观察贴壁细胞数量减少;20μg/ml Molday IONTM EverGreen较长期（6周）标记细胞后，荧光显微镜观察到荧光强度降低，但有绿色荧光显影的细胞比例仍可达93％。细胞活力检测（台盼蓝染色法）20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天、1周、2周、3周、4周、5周、6周的细胞台盼蓝拒染率，并与未标记细胞进行统计学比较，证明20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记后对BMSCs活力的影响不具有统计学意义(p＞0.05)。荧光染料HOECHST33342/PI双染细胞核观察10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的Molday IONTM EverGreen标记BMSCs与未标记干细胞组细胞死亡率均值分别为5％、5％、8％和4％。体外MR扫描显示不同浓度Molday IONTM EverGreen标记的第三代BMSCs(细胞数1×106/ml)T1信号强度无明显差异，T2WI上各标记浓度组均引起信号的减低，Molday IONTM EverGreen浓度越高引起的信号减低越明显，T2信号强度随Molday IONTM EverGreen浓度的增加而降低。
结论：
应用本实验方法，能够在离体情况下方便快速地分离、培养出大鼠BMSCs，且可以稳定传代，可用于进一步的动物体内研究。使用适宜浓度（20μg/ml）的双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记BMSCs标记效率高，标记较长时间（6周）的标记率仍能保持在93％，而且对BMSCs的活力以及存活率无影响。体外MR扫描T2WI序列可敏感地发现不同浓度Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后信号强度变化。为活体移植BMSCs后进行MR示踪奠定了实验基础。
影像技术的进步和成像试剂的创新，使分子成像技术得到了快速发展。在分子成像领域，通过分子生物学和影像技术的结合，使在分子或细胞水平上进行研究和诊断的能力得到了飞速提升。医学分子成像技术有许多成像设备，如US、CT、MRI、OI、PET、SPECT等，这些分子影像设备在成像灵敏度、空间和时间分辨率等性能方面都有各自的优缺点，它们可以为临床工作人员及基础研究人员提供人或动物细胞甚至分子水平的信息，也能够提供从形态结构到功能代谢等方面的详细信息。这些成像技术的联合使用，可以弥补单独使用某一种成像方法的不足。比如，在动物实验研究中，多种分子影像设备（如MRI）在无需处死实验动物的情况下即可实现对动物的长期非侵入性的观察，但是，其空间分辨率以及信噪比(Signal-to-noise ratio，SNR)存在一定的不足。因此，常常需要通过使用对比剂或分子影像探针，或结合其他影像学检查方法进行双/多模态成像来改进空间分辨率和SNR。理论上，双模态和多模态医学检查仅需要使用一种探针，而且，通过这种多模式成像可以获得更准确和完整的信息，帮助临床医生早期发现疾病，改善诊断和进行疗效评估。目前，双模态和多模态医学影像方法越来越多的应用于小动物的分子成像研究，双模态和多模态对比剂也广泛应用于标记移植细胞的动物体内示踪。
本课题以荧光及MR双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓来源的间充质干细胞，由于MR检查序列中的T2WI序列可对顺磁性物质标记的细胞进行体内示踪，显示为低信号区，因此可以对Molday IONTM EverGreen标记的大鼠骨髓来源的间充质干细胞进行体内外检测示踪，同时研究其对同种异体移植大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的抗损伤、抗凋亡、促修复的作用。
目前，随着医学影像技术后处理应用研究技术的发展，磁共振(Magnetic resonance imaging，MRI)成像技术不仅可以利用MR非侵袭性的方法观测到活体组织中细胞的迁移和增殖状况，而且可以通过定量或半定量后处理分析软件对细胞移植后的器官功能、血流动力学变化进行评价，对于评估干细胞移植的效果有重要意义，本研究采用动态增强(Dynamic contrast-enhanced，DCE)MRI扫描方法结合定量后处理软件分析大鼠肝脏缺血再灌注损伤区域肝组织微血管的血流动力学参数，为干细胞体内移植治疗肝脏缺血再灌注损伤提供了帮助。研究共分为以下两个部分。
第一部分 双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓间充质干细胞及体外MR成像研究
目的：
骨髓间充质干细胞在体外一定条件诱导下具有多向分化的能力，因此，在组织工程研究中成为使用越来越广泛的种子细胞。若想借助医学影像设备深入研究BMSCs在体内的分布、增殖情况及其对器官功能的影响，首先必须要解决如何能安全、高效地使用影像显影剂标记BMSCs的问题。本文采用荧光和磁性双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓来源间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)，探讨Molday IONTM EverGreen标记BMSCs的适宜标记浓度及其标记BMSCs6周以内不同时间点的细胞活力和标记率;初探Molday IONTM EverGreen标记BMSCs进行体外MR成像的可行性，为进一步研究BMSCs移植后的活体示踪提供实验依据。
方法：
分离、培养、传代大鼠BMSCs后，使用三种浓度的（铁浓度为10、20、50μg/ml）Molday IONTM EverGreen对第三代BMSCs进行荧光及磁性双标记，通过普鲁士蓝染色观察细胞铁标记率、荧光镜观察细胞的荧光标记率，比较三种浓度Molday IONTM EverGreen标记BMSCs的阳性标记率;观察20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天及1周、2周、4周、6周细胞的荧光标记率。台盼蓝拒染法检测20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天及1周、2周、3周、4周、5周、6周的细胞活力。使用荧光染料HOECHST33342/PI双染Molday IONTM EverGreen-BMSCs细胞核后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察三种浓度Molday IONTM EverGreen（铁浓度为10、20、50μg/ml）标记BMSCs的存活率。应用3.0T MR扫描仪对不同浓度Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs行T1、T2序列扫描，确定Molday IONTM EverGreen标记BMSCs的最佳标记浓度。
结果：
BMSCs原代早期细胞呈圆形、三角形、多角形，少数呈梭形，原代晚期呈梭形居多，体外传至第二代培养1周即可达到80％左右的细胞融合，形态上呈比原代细胞更为均匀的长梭形;体外传至第三代，BMSCs基本纯化，经细胞鉴定（免疫荧光检测鉴定法）细胞表面标记物CD29(+)、CD34(-)、CD44(+)、CD45(-)。三种浓度Molday IONTM EverGreen（铁浓度为10、20、50μg/ml）标记BMSCs后经普鲁士蓝染色和荧光镜观察标记率均接近100％，而对照组（无Molday IONTM EverGreen标记）标记率为零。普鲁士蓝染色显示Molday IONTM EverGreen-BMSCs胞质内蓝染的铁颗粒，且随Molday IONTM EverGreen标记浓度增加，蓝染物质增多、颜色加深。三种浓度Molday IONTM EverGreen的细胞荧光标记率均接近100％，但10μg/ml Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs细胞质的荧光强度欠佳，而50μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后培养16h观察贴壁细胞数量减少;20μg/ml Molday IONTM EverGreen较长期（6周）标记细胞后，荧光显微镜观察到荧光强度降低，但有绿色荧光显影的细胞比例仍可达93％。细胞活力检测（台盼蓝染色法）20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天、1周、2周、3周、4周、5周、6周的细胞台盼蓝拒染率，并与未标记细胞进行统计学比较，证明20μg/ml Molday IONTM EverGreen标记后对BMSCs活力的影响不具有统计学意义(p＞0.05)。荧光染料HOECHST33342/PI双染细胞核观察10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的Molday IONTM EverGreen标记BMSCs与未标记干细胞组细胞死亡率均值分别为5％、5％、8％和4％。体外MR扫描显示不同浓度Molday IONTM EverGreen标记的第三代BMSCs(细胞数1×106/ml)T1信号强度无明显差异，T2WI上各标记浓度组均引起信号的减低，Molday IONTM EverGreen浓度越高引起的信号减低越明显，T2信号强度随Molday IONTM EverGreen浓度的增加而降低。
结论：
应用本实验方法，能够在离体情况下方便快速地分离、培养出大鼠BMSCs，且可以稳定传代，可用于进一步的动物体内研究。使用适宜浓度（20μg/ml）的双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记BMSCs标记效率高，标记较长时间（6周）的标记率仍能保持在93％，而且对BMSCs的活力以及存活率无影响。体外MR扫描T2WI序列可敏感地发现不同浓度Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后信号强度变化。为活体移植BMSCs后进行MR示踪奠定了实验基础。