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支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早产儿、尤其是小早产儿呼吸系统常见疾病，是影响新生儿远期预后的3大高危因素之一。BPD主要由围生期感染、机械通气、高氧暴露等引起。近年来，随着新生儿重症监护技术的提高，早产儿尤其是极低出生体重儿存活率增加，BPD等早产儿相关疾病发病率也有所上升，超低出生体重儿中BPD发生率达到30％。BPD患儿不仅其肺功能受到严重损害，其体格发育以及神经系统发育也受很大影响，造成家庭和社会的沉重负担。因此，迫切需要了解BPD的发生机制从而寻求有效的防治措施减少并减轻早产儿BPD，最终改善早产儿远期生存质量。
研究发现，血管生长与肺泡发育密切相关，抑制血管的正常生长直接导致肺泡化受阻，Abman由此提出肺发育的“血管假说”，肺血管发育紊乱及肺泡化阻滞是BPD发生发展的关键事件。目前认为肺血管发育和肺泡化与众多因素有关，包括基因表达调控，生长因子的表达，细胞外基质的产生和成熟，以及呼吸运动的协同作用等。生长因子被认为在肺血管发育和肺泡化中起关键作用，在晚期肺发育以及BPD发展中，多种生长因子信号被发现。
胎盘生长因子(Placental growth factor，PlGF)是一种分泌型同型二聚体糖蛋白，相对分子质量为29×103，是血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)家族中的一员。PlGF主要表达于胎盘、甲状腺、肺等组织，与血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor1，VEGFR1，也即Flt-1）结合而发挥调节血管发育等作用。PlGF只参与病理状态下的新生血管形成，而对正常血管发育影响不大。PlGF可引起白细胞浸润，肿瘤生长，基质细胞迁移，缺血组织血管再通;PlGF可趋化单核细胞和巨噬细胞，并激活巨噬细胞释放炎症因子，PlGF表达缺陷的小鼠组织内巨噬细胞浸润减少，炎症反应减轻;阻断PlGF的受体Flt-1可以有效抑制动脉粥样硬化、关节炎等的血管炎症反应;另外，抑制PlGF活性可降低肝硬化小鼠纤维化和炎症的严重性;肿瘤动物模型研究中，用抗PlGF单克隆抗体治疗能抑制肿瘤生长、血管新生及巨噬细胞聚集，而不影响健康组织。
正常情况下，PlGF及受体Flt-1在人类妊娠期的后三个月表达增加，即在肺发育的囊泡肺泡期及泡状肺泡期表达增高，而在肺间隔形成及肺泡化过程中迅速下调。据此，推测晚期发育肺在受损后过度表达PlGF，PlGF促进肺血管内皮细胞激活、增殖及迁移，导致肺血管紊乱，同时激活巨噬细胞释放炎症因子，肺泡上皮细胞损伤、转化受阻，肺泡化停止，最后导致BPD的发生;同时，假定，在早产儿BPD动物模型中，抗PlGF单克隆抗体在肺损伤高PlGF介导的肺血管异常增殖中可能发挥阻断作用。
第一部分 PlGF过表达对高氧暴露损伤胚肺上皮细胞模型的影响
目的：
分析高氧处理及过表达胎盘生长因子(Placental growth factor,PlGF)PlGF对肺微血管内皮细胞（Pulmonary microvascular endothelial cells，PMEC）和肺微血管上皮细胞(TypeⅡalveolar epithelial cell，AEC-Ⅱ)的影响。
方法：
1.通过基因合成得到PlGF过表达腺病毒质粒和菌株。PlGF过表达腺病毒质粒以及包装质粒转染293a细胞，收集P1和P2代腺病毒液，超速离心法纯化浓缩，并通过进行滴度测定。
2.阴性对照空病毒命名为Ad-NC，表达PlGF的腺病毒命名为Ad-PlGF。高氧环境中培养PMEC和AEC-Ⅱ细胞构建高氧模型。通过感染PMEC和AEC-Ⅱ细胞PlGF过表达腺病毒获得PlGF腺病毒组。以正常培养的细胞和腺病毒感染(Ad-NC)的细胞作为对照。
3.免疫荧光检测PlGF在各组细胞中的表达情况;ELISA检测ICAM-1/CD54和VEGFR1在各组细胞中的表达情况;Transwell检测各组细胞迁移能力;
4.qPCR和western blot检测各组细胞内E-cadherin、COL1A1、FN和α-SMA的表达变化。
结果：
1.经过检测，病毒滴度为2×1010PFU/ml。免疫荧光结果表明，高氧处理和PlGF过表达腺病毒感染均可以增加PMEC和AEC-Ⅱ细胞内PlGF的表达水平。结果说明，模型构建成功，可以用于后续的实验。
2.ELISA结果表明，高氧处理和PlGF过表达可以诱导ICAM-1/CD54和VEGFR1的高表达。Transwell检测结果表明，高氧处理和PlGF过表达可以提高PMEC和AEC-Ⅱ细胞的迁移能力。
3.qPCR和western blot检测结果表明高氧处理和PlGF过表达均可以明显降低PMECA和AEC-Ⅱ细胞中上皮间质转化相关蛋白E-cadherin mRNA和蛋白水平的表达，增加纤维化标志物COL1A1、FN和α-SMA mRNA和蛋白水平的表达。
结论：
高氧处理和PlGF过表达可以增强PMECA和AEC-Ⅱ细胞的血管形成能力、迁移能力，诱导细胞出现上皮间质转化和纤维化。
第二部分 抗PlGF单克隆抗体对高氧诱导早产儿支气管肺发育不良大鼠模型的影响
目的：
分析抗PlGF抗体对新生大鼠高氧性肺损伤的影响，以及明确过表达PlGF是否可以引起新生大鼠的肺损伤。
方法：
1.根据蛋白的氨基酸序列，优化和合成PlGF序列，并构建至原核表达载体PGEX-6p-1。将PGEX-6p-1-PlGF阳性质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3)。SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况。利用高亲和性NI树脂纯化PlGF蛋白，尿素复性。将获得的蛋白免疫新西兰大白兔。最后一次免疫后第14天，采血，纯化抗体。
2.将新生大鼠随机分配入空气组、空气+腺病毒组、空气+空载腺病毒组、高氧模型组和高氧+抗PlGF抗体组。
3.HE染色观察肺组织病理变化;透射电镜电镜观察肺细胞超微结构。
4.qPCR和western blot检测PlGF及受体Flt-1基因的表达。
5.ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6水平;制作肺泡灌洗液的细胞悬液做涂片，苏木素染色后计数细胞数量;免疫组化检测CD34的变化。
结果：
1.PlGF的多克隆抗体的效价为1∶243000，符合后续实验的要求。造模后，各组乳大鼠未见异常，母鼠生长情况良好。腺病毒和抗PlGF抗体干预后也未见动物有异常反应。至实验结束，无动物异常死亡。
2.HE染色和透射电镜的结果显示，注射PlGF过表达腺病毒和高氧均可以引起新生大鼠出现明显的肺损伤，注射抗PlGF抗体可以明显改善高氧引起的肺组织损伤。
3.qPCR和western blot结果表明，注射PlGF过表达腺病毒可以明显增加肺组织中PlGF及受体Flt-1mRNA和蛋白的表达水平;与空气组相比，高氧组和高氧+抗PlGF抗体组的PlGF及受体Flt-1蛋白的表达水平均明显升高。
4.ELISA结果表明，注射PlGF过表达腺病毒和高氧处理均可以明显增加肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平;与高氧组相比，高氧+抗体组肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平明显降低。苏木素染色结果表明，注射PlGF过表达腺病毒和高氧均可以降低单核细胞和中性粒细胞的数量;与高氧组相比，高氧+抗体组的单核细胞和中性粒细胞没有明显的变化。免疫组化结果表明，注射PlGF过表达腺病毒和高氧处理均可以明显增加CD34的表达;与高氧组相比，高氧+抗体组CD34的表达明显降低。
结论：
1.高氧可以诱导新生大鼠肺组织中PlGF及受体Flt-1mRNA和蛋白表达水平的上调;高氧组新生大鼠肺损伤加重，肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平明显升高，CD34的表达水平明显增多;注射PlGF过表达的慢病毒的新生大鼠肺组织也出现和高氧组相似的变化。PlGF在高氧诱导的新生大鼠的肺组织损伤中发挥调控作用。
2.阻断PlGF的作用可以明显改善肺组织的损伤，降低肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6的表达水平以及肺组织中CD34的表达水平。该结果将为临床寻求防治早产儿支气管肺发育不良提供新的思路，具有重要的转化医学意义。
研究发现，血管生长与肺泡发育密切相关，抑制血管的正常生长直接导致肺泡化受阻，Abman由此提出肺发育的“血管假说”，肺血管发育紊乱及肺泡化阻滞是BPD发生发展的关键事件。目前认为肺血管发育和肺泡化与众多因素有关，包括基因表达调控，生长因子的表达，细胞外基质的产生和成熟，以及呼吸运动的协同作用等。生长因子被认为在肺血管发育和肺泡化中起关键作用，在晚期肺发育以及BPD发展中，多种生长因子信号被发现。
胎盘生长因子(Placental growth factor，PlGF)是一种分泌型同型二聚体糖蛋白，相对分子质量为29×103，是血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)家族中的一员。PlGF主要表达于胎盘、甲状腺、肺等组织，与血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor1，VEGFR1，也即Flt-1）结合而发挥调节血管发育等作用。PlGF只参与病理状态下的新生血管形成，而对正常血管发育影响不大。PlGF可引起白细胞浸润，肿瘤生长，基质细胞迁移，缺血组织血管再通;PlGF可趋化单核细胞和巨噬细胞，并激活巨噬细胞释放炎症因子，PlGF表达缺陷的小鼠组织内巨噬细胞浸润减少，炎症反应减轻;阻断PlGF的受体Flt-1可以有效抑制动脉粥样硬化、关节炎等的血管炎症反应;另外，抑制PlGF活性可降低肝硬化小鼠纤维化和炎症的严重性;肿瘤动物模型研究中，用抗PlGF单克隆抗体治疗能抑制肿瘤生长、血管新生及巨噬细胞聚集，而不影响健康组织。
正常情况下，PlGF及受体Flt-1在人类妊娠期的后三个月表达增加，即在肺发育的囊泡肺泡期及泡状肺泡期表达增高，而在肺间隔形成及肺泡化过程中迅速下调。据此，推测晚期发育肺在受损后过度表达PlGF，PlGF促进肺血管内皮细胞激活、增殖及迁移，导致肺血管紊乱，同时激活巨噬细胞释放炎症因子，肺泡上皮细胞损伤、转化受阻，肺泡化停止，最后导致BPD的发生;同时，假定，在早产儿BPD动物模型中，抗PlGF单克隆抗体在肺损伤高PlGF介导的肺血管异常增殖中可能发挥阻断作用。
第一部分 PlGF过表达对高氧暴露损伤胚肺上皮细胞模型的影响
目的：
分析高氧处理及过表达胎盘生长因子(Placental growth factor,PlGF)PlGF对肺微血管内皮细胞（Pulmonary microvascular endothelial cells，PMEC）和肺微血管上皮细胞(TypeⅡalveolar epithelial cell，AEC-Ⅱ)的影响。
方法：
1.通过基因合成得到PlGF过表达腺病毒质粒和菌株。PlGF过表达腺病毒质粒以及包装质粒转染293a细胞，收集P1和P2代腺病毒液，超速离心法纯化浓缩，并通过进行滴度测定。
2.阴性对照空病毒命名为Ad-NC，表达PlGF的腺病毒命名为Ad-PlGF。高氧环境中培养PMEC和AEC-Ⅱ细胞构建高氧模型。通过感染PMEC和AEC-Ⅱ细胞PlGF过表达腺病毒获得PlGF腺病毒组。以正常培养的细胞和腺病毒感染(Ad-NC)的细胞作为对照。
3.免疫荧光检测PlGF在各组细胞中的表达情况;ELISA检测ICAM-1/CD54和VEGFR1在各组细胞中的表达情况;Transwell检测各组细胞迁移能力;
4.qPCR和western blot检测各组细胞内E-cadherin、COL1A1、FN和α-SMA的表达变化。
结果：
1.经过检测，病毒滴度为2×1010PFU/ml。免疫荧光结果表明，高氧处理和PlGF过表达腺病毒感染均可以增加PMEC和AEC-Ⅱ细胞内PlGF的表达水平。结果说明，模型构建成功，可以用于后续的实验。
2.ELISA结果表明，高氧处理和PlGF过表达可以诱导ICAM-1/CD54和VEGFR1的高表达。Transwell检测结果表明，高氧处理和PlGF过表达可以提高PMEC和AEC-Ⅱ细胞的迁移能力。
3.qPCR和western blot检测结果表明高氧处理和PlGF过表达均可以明显降低PMECA和AEC-Ⅱ细胞中上皮间质转化相关蛋白E-cadherin mRNA和蛋白水平的表达，增加纤维化标志物COL1A1、FN和α-SMA mRNA和蛋白水平的表达。
结论：
高氧处理和PlGF过表达可以增强PMECA和AEC-Ⅱ细胞的血管形成能力、迁移能力，诱导细胞出现上皮间质转化和纤维化。
第二部分 抗PlGF单克隆抗体对高氧诱导早产儿支气管肺发育不良大鼠模型的影响
目的：
分析抗PlGF抗体对新生大鼠高氧性肺损伤的影响，以及明确过表达PlGF是否可以引起新生大鼠的肺损伤。
方法：
1.根据蛋白的氨基酸序列，优化和合成PlGF序列，并构建至原核表达载体PGEX-6p-1。将PGEX-6p-1-PlGF阳性质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3)。SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况。利用高亲和性NI树脂纯化PlGF蛋白，尿素复性。将获得的蛋白免疫新西兰大白兔。最后一次免疫后第14天，采血，纯化抗体。
2.将新生大鼠随机分配入空气组、空气+腺病毒组、空气+空载腺病毒组、高氧模型组和高氧+抗PlGF抗体组。
3.HE染色观察肺组织病理变化;透射电镜电镜观察肺细胞超微结构。
4.qPCR和western blot检测PlGF及受体Flt-1基因的表达。
5.ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6水平;制作肺泡灌洗液的细胞悬液做涂片，苏木素染色后计数细胞数量;免疫组化检测CD34的变化。
结果：
1.PlGF的多克隆抗体的效价为1∶243000，符合后续实验的要求。造模后，各组乳大鼠未见异常，母鼠生长情况良好。腺病毒和抗PlGF抗体干预后也未见动物有异常反应。至实验结束，无动物异常死亡。
2.HE染色和透射电镜的结果显示，注射PlGF过表达腺病毒和高氧均可以引起新生大鼠出现明显的肺损伤，注射抗PlGF抗体可以明显改善高氧引起的肺组织损伤。
3.qPCR和western blot结果表明，注射PlGF过表达腺病毒可以明显增加肺组织中PlGF及受体Flt-1mRNA和蛋白的表达水平;与空气组相比，高氧组和高氧+抗PlGF抗体组的PlGF及受体Flt-1蛋白的表达水平均明显升高。
4.ELISA结果表明，注射PlGF过表达腺病毒和高氧处理均可以明显增加肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平;与高氧组相比，高氧+抗体组肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平明显降低。苏木素染色结果表明，注射PlGF过表达腺病毒和高氧均可以降低单核细胞和中性粒细胞的数量;与高氧组相比，高氧+抗体组的单核细胞和中性粒细胞没有明显的变化。免疫组化结果表明，注射PlGF过表达腺病毒和高氧处理均可以明显增加CD34的表达;与高氧组相比，高氧+抗体组CD34的表达明显降低。
结论：
1.高氧可以诱导新生大鼠肺组织中PlGF及受体Flt-1mRNA和蛋白表达水平的上调;高氧组新生大鼠肺损伤加重，肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6表达水平明显升高，CD34的表达水平明显增多;注射PlGF过表达的慢病毒的新生大鼠肺组织也出现和高氧组相似的变化。PlGF在高氧诱导的新生大鼠的肺组织损伤中发挥调控作用。
2.阻断PlGF的作用可以明显改善肺组织的损伤，降低肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6的表达水平以及肺组织中CD34的表达水平。该结果将为临床寻求防治早产儿支气管肺发育不良提供新的思路，具有重要的转化医学意义。