【摘 要】
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羊痘(山羊痘和绵羊痘)是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)病毒引起的山羊及绵羊的一种急性、热性、高度接触性传染病。本病在印度、孟加拉、中东以及非洲中北部地区呈地方性流行,
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羊痘(山羊痘和绵羊痘)是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)病毒引起的山羊及绵羊的一种急性、热性、高度接触性传染病。本病在印度、孟加拉、中东以及非洲中北部地区呈地方性流行,对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病,在我国被列为一类传染病。本试验对山羊痘病毒荧光PCR检测方法的建立、体外增殖规律、基因组酶切图谱差异及TK基因进行了相关研究。1.山羊痘病毒SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法的建立为建立山羊痘病毒(goat poxvirus,GPV)的SYBR GreenⅠ模式荧光PCR方法,根据山羊痘病毒的反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘疹提取的DNA为模板,建立并优化SYBR GreenⅠ模式荧光PCR检测山羊痘病毒的ITR基因的方法,并与普通PCR方法进行敏感性比较。结果表明:所建立的检测山羊痘病毒的SYBR GreenⅠ模式荧光PCR方法能检测出7×10~2拷贝数的DNA模板,比文献报道的普通PCR法更敏感、准确、快速。2.山羊痘病毒体外增殖规律初探将山羊痘病毒标准弱毒株(B)和分离毒株(LD)接种Vero细胞,感染细胞后每隔12 h观察细胞病变并收获细胞培养物,用已建立的SYBRGreenⅠ模式荧光PCR检测细胞培养物中山羊痘病毒含量并绘制生长曲线,可见:在Vero细胞中,二个毒株的增殖规律基本相似,山羊痘病毒各毒株在感染12 h时细胞培养物中的病毒含量就开始增加,在72 h～96 h时CPE最为明显,Vero细胞中的病毒含量也达到最高。从而进一步了解了山羊痘病毒的增殖规律,山羊痘病毒在Vero细胞中的增殖高峰期为72 h～96 h,也是病毒收获的最佳时期,为疫苗的生产及后续试验提供了科学依据。3.山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析山羊痘病毒贵州分离株(LD株和QL株)和参考株(Y株和B株),采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以三种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切,并进行酶切图谱分析,得出结果:病毒基因组提取样本的纯度在1.8～1.9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,而比参考弱毒株B株少3～4条酶切片段。为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究提供了基础。4.山羊痘病毒TK基因的克隆与序列分析设计特异性引物并应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B株TK基因序列片段,将其克隆至pMD 18-T载体,构建重组质粒pMD 18-T-TK。再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。TK基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4株测序毒株TK基因与参考毒株的同源性均为96.6%～100%,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。
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