论文部分内容阅读
苄基异喹啉类生物碱及其衍生物，是来源于苯丙氨酸和/或酪氨酸的一类含氮次级代谢产物，广泛分布于植物、动物和微生物中。这类生物碱包含了超过2500个化合物，它们结构类型众多，其中大部分具有生物活性，部分已经在临床中使用。
在苄基异喹啉生物碱及其衍生物的生物合成过程中有两个重要的酶，(1)(S)-norcoclaurine synthase(NCS;EC4.2.1.78)催化3，4-二羟基苯乙胺(dopamine)与4-羟基苯乙醛(4-HPAA)的缩合反应，此反应是进入异喹啉类生物碱生物合成的第一个关键步骤，该反应是立体特异性的Pictet-Spengler环化反应，产物为苄基异喹啉生物碱。(2)Berberine bridge enzyme(BBE;EC1.21.3.3)是双共价黄素蛋白家族的一个成员，催化(S)-reticuline到(S)-scoulerine的立体特异性转化，使其在N-甲基基团和酚醛环之间形成新的C-C键，是苄基异喹啉生物碱转化为小檗碱类生物的关键步骤。
迄今，在拟南芥（Arab idopsis thal iana）中尚未发现复杂生物碱，但其基因组测序结果表明拟南芥含有众多可能与复杂生物碱生物合成相关的基因，其中与Ncs类似的基因有35个，与Bbe类似的基因有12个。为研究拟南芥中是否存在苄基异喹啉类生物碱及其衍生物的生物合成，我们对拟南芥中的基因进行了详细的生物信息学分析。基于与已知功能的NCS、BBE及拟南芥中NCS和BBE序列的分析，我们确定了5个与已知功能的NCS具有高度相似性和4个与已知功能的BBE具有高度相似性的目的基因。采用RT-PCR技术克隆了上述9个基因的全长cDNA，并将纯化回收的目的基因产物定向插入克隆载体pGM-T中进行测序分析;经DNA测序，并与Genbank中已有序列进行比对，其核苷酸同源性高于99％。
采用双酶切方法，将目的基因定向连接于表达载体pET-28a或pET-30a中，转化大肠杆菌（Escherichia Coli）表达菌株BL21(DE3)或Rosetta(DE3)，并进行卡那霉素抗性筛选及PCR、双酶切和测序验证，最终构建成表达菌株。
将含有目标基因的大肠杆菌用IPTG诱导表达后进行全蛋白SDS-PAGE分析，结果表明，与空白菌作对照，上述表达菌均出现目标条带。对所有异源表达蛋白进行分离纯化及体外的酶活测试，结果表明，这些异源蛋白在大肠杆菌表达系统中不具有推测的NCS或BBE催化活性。综上，在我们的实验中，未能发现拟南芥基因组中注释为Ncs和Bbe的基因具有预期功能。