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【研究背景】低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension， HPAH)是慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要并发症之一。慢性肺血管重塑是HPAH发病的主要环节，肺血管平滑肌细胞增殖在肺血管重塑过程中发挥关键作用。低氧不仅引起肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)增殖进而导致肺动脉血管重塑，低氧也可以导致肺静脉平滑肌细胞(Pulmonary veinous smooth muscle cell,PVSMC)增殖和血管重塑。本课题组前期研究发现慢性低氧可导致大鼠远端PVSMC增殖，而钙敏感受体(Ca2+-sensingreceptor，CaSR)及经典瞬时电位受体蛋白(Transient receptor potential canonical protein，TRPC)参与了低氧引起的PVSMC增殖。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor， EGF)及血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)对PASMC具有促增殖作用，参与HPAH发病。目前关于VEGF、EGF及PDGF-BB对PVSMC增殖影响的研究尚无报道，VEGF、EGF及PDGF-BB是否参与低氧引起的PVSMC增殖及各自机制尚不清楚，CaSR和TRPC是否参与其中也不清楚。
【研究目的】本研究通过原代培养大鼠远端PVSMC研究VEGF、EGF及PDGF-BB对常氧和低氧PVSMC增殖的影响，明确CaSR和TRPC是否参与VEGF、EGF或PDGF-BB导致的常氧或低氧PVSMC增殖。
【研究方法】
(一)VEGF、EGF及PDGF-BB对大鼠远端PVSMC增殖的影响
1、大鼠远端PVSMC原代培养及鉴定
体式显微镜镜下分离肺静脉(4级以下)，胶原酶消化肺静脉成PVSMC。通过细胞形态、平滑肌α-actin、Vimentin及Ⅷ因子等特征性蛋白免疫荧光染色鉴定细胞。
2、不同浓度的VEGF、EGF、PDGF-BB对PVSMC细胞活力的影响
运用CCK8法观察不同浓度(5ng/ml、10ng/ml 、15ng/ml、20ng/ml)VEGF、EGF、PDGF-BB对PVSMC的细胞活力影响。
3、PDGF-BB对低氧PVSMC增殖的影响
慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/ml的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，采用细胞计数、CCK-8法、EdU法观察PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期细胞比例的变化。
(二)PDGF-BB促低氧大鼠远端PVSMC增殖的机制
1、PDGF-BB对低氧大鼠远端PVSMCCaSR、TRPC6表达的影响
慢性低氧条件(4% O2)，15ng/ml的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，采用western-blot方法检测大鼠远端PVSMCCaSR、TRPC6蛋白表达的变化。
2、CaSR激动剂及阻滞剂对PDGF-BB促低氧PVSMC增殖的影响
慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/ml的PDGF-BB孵育大鼠远端PVSMC，加用CaSR激动剂(2μM精胺)及阻滞剂(5μMNPS2143)作用细胞48h后，采用细胞计数、CCK-8法以及EdU法观察PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期细胞比例的变化。
3、慢性低氧与PDGF-BB作用下，大鼠远端PVSMCCaSR与TRPC6的调控关系及对PVSMC细胞增殖的影响
(1)CaSR特异性siRNA(siCaSR)对PDGF-BB促低氧PVSMC的TRPC6表达及细胞增殖的影响；
(2)TRPC6特异性siRNA(siTRPC6)对PDGF-BB促低氧PVSMC的CaSR表达及细胞增殖的影响。
【实验结果】
(一)VEGF、EGF及PDGF-BB对大鼠远端PVSMC细胞活力的影响
1、大鼠远端PVSMC原代培养及鉴定
原代培养大鼠远端PVSMC后，α肌动蛋白免疫荧光染色呈强阳性，波形蛋白及Ⅷ因子荧光染色呈阴性，细胞纯度达98%。
2、不同浓度的VEGF、EGF、PDGF-BB对PVSMC细胞活力的影响
(1)常氧或低氧条件下，5、10、15、20ng/ml的VEGF作用下细胞活力较对照组细胞活力无改变；
(2)常氧条件下，5、10、15、20ng/ml的EGF作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。低氧条件下，5、10、15、20ng/ml的EGF作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。但低氧+EGF组与常氧+EGF组的细胞活力比较却没有统计学差异；
(3)常氧条件下，5、10、15、20ng/ml的PDGF-BB作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。在低氧条件下，5、10、15、20ng/ml的PDGF-BB的作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。同时，加入15ng/mlPDGF-BB后，低氧+PDGF-BB组细胞活力较常氧+PDGF-BB组高。
3、PDGF-BB对低氧PVSMC增殖的影响
常氧(21% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，大鼠远端PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高，而慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较则进一步升高。
(二)PDGF-BB促低氧大鼠远端PVSMC增殖的机制
1、PDGF-BB对低氧大鼠远端PVSMCCaSR、TRPC6表达的影响
常氧(21% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，大鼠远端PVSMC的CaSR和TRPC6蛋白表达水平与对照组比较均显著升高；而慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，PVSMC的CaSR和TRPC6蛋白表达水平与对照组比较均显著升高。
2、CaSR激动剂及阻滞剂对PDGF-BB促低氧PVSMC增殖的影响
慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB孵育大鼠远端PVSMC，加用CaSR激动剂(2μM精胺)作用细胞48h后，大鼠远端PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高。相反，加用CaSR阻滞剂(5μMNPS2143)作用细胞48h后，大鼠远端PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著下降。
3、慢性低氧与PDGF-BB作用下，大鼠远端PVSMCCaSR与TRPC6的调控关系及对PVSMC细胞增殖的影响
(1)CaSR特异性siRNA(siCaSR)对PDGF-BB促低氧PVSMC的TRPC6表达及细胞增殖的影响
慢性低氧和PGDF-BB作用下，siCaSR对大鼠远端PVSMCTRPC6的蛋白水平表达呈抑制作用，且siCaSR显著抑制低氧和PDGF-BB作用下引起的大鼠远端PVSMC的细胞数升高、细胞活力增强及处于S期的细胞比例的升高。
(2)TRPC6特异性siRNA(siTRPC6)对PDGF-BB促低氧PVSMC的CaSR表达及细胞增殖的影响
慢性低氧和PGDF-BB作用下，siTRPC6对大鼠远端PVSMCCaSR的蛋白水平表达均无影响，但是siTRPC6显著抑制低氧和PDGF-BB作用下引起的大鼠远端PVSMC的细胞数升高、细胞活力增强及处于S期的细胞比例的升高。
【实验结论】
1、VEGF对大鼠远端PVSMC增殖无影响，EGF和PDGF-BB能促进大鼠远端PVSMC增殖，PDGF-BB对PVSMC促增殖作用在慢性低氧条件下更强。
2、PDGF-BB通过CaSR和TRPC6参与促进低氧大鼠远端PVSMC增殖。
【研究目的】本研究通过原代培养大鼠远端PVSMC研究VEGF、EGF及PDGF-BB对常氧和低氧PVSMC增殖的影响，明确CaSR和TRPC是否参与VEGF、EGF或PDGF-BB导致的常氧或低氧PVSMC增殖。
【研究方法】
(一)VEGF、EGF及PDGF-BB对大鼠远端PVSMC增殖的影响
1、大鼠远端PVSMC原代培养及鉴定
体式显微镜镜下分离肺静脉(4级以下)，胶原酶消化肺静脉成PVSMC。通过细胞形态、平滑肌α-actin、Vimentin及Ⅷ因子等特征性蛋白免疫荧光染色鉴定细胞。
2、不同浓度的VEGF、EGF、PDGF-BB对PVSMC细胞活力的影响
运用CCK8法观察不同浓度(5ng/ml、10ng/ml 、15ng/ml、20ng/ml)VEGF、EGF、PDGF-BB对PVSMC的细胞活力影响。
3、PDGF-BB对低氧PVSMC增殖的影响
慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/ml的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，采用细胞计数、CCK-8法、EdU法观察PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期细胞比例的变化。
(二)PDGF-BB促低氧大鼠远端PVSMC增殖的机制
1、PDGF-BB对低氧大鼠远端PVSMCCaSR、TRPC6表达的影响
慢性低氧条件(4% O2)，15ng/ml的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，采用western-blot方法检测大鼠远端PVSMCCaSR、TRPC6蛋白表达的变化。
2、CaSR激动剂及阻滞剂对PDGF-BB促低氧PVSMC增殖的影响
慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/ml的PDGF-BB孵育大鼠远端PVSMC，加用CaSR激动剂(2μM精胺)及阻滞剂(5μMNPS2143)作用细胞48h后，采用细胞计数、CCK-8法以及EdU法观察PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期细胞比例的变化。
3、慢性低氧与PDGF-BB作用下，大鼠远端PVSMCCaSR与TRPC6的调控关系及对PVSMC细胞增殖的影响
(1)CaSR特异性siRNA(siCaSR)对PDGF-BB促低氧PVSMC的TRPC6表达及细胞增殖的影响；
(2)TRPC6特异性siRNA(siTRPC6)对PDGF-BB促低氧PVSMC的CaSR表达及细胞增殖的影响。
【实验结果】
(一)VEGF、EGF及PDGF-BB对大鼠远端PVSMC细胞活力的影响
1、大鼠远端PVSMC原代培养及鉴定
原代培养大鼠远端PVSMC后，α肌动蛋白免疫荧光染色呈强阳性，波形蛋白及Ⅷ因子荧光染色呈阴性，细胞纯度达98%。
2、不同浓度的VEGF、EGF、PDGF-BB对PVSMC细胞活力的影响
(1)常氧或低氧条件下，5、10、15、20ng/ml的VEGF作用下细胞活力较对照组细胞活力无改变；
(2)常氧条件下，5、10、15、20ng/ml的EGF作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。低氧条件下，5、10、15、20ng/ml的EGF作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。但低氧+EGF组与常氧+EGF组的细胞活力比较却没有统计学差异；
(3)常氧条件下，5、10、15、20ng/ml的PDGF-BB作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。在低氧条件下，5、10、15、20ng/ml的PDGF-BB的作用下细胞活力较对照组细胞活力升高。同时，加入15ng/mlPDGF-BB后，低氧+PDGF-BB组细胞活力较常氧+PDGF-BB组高。
3、PDGF-BB对低氧PVSMC增殖的影响
常氧(21% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，大鼠远端PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高，而慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较则进一步升高。
(二)PDGF-BB促低氧大鼠远端PVSMC增殖的机制
1、PDGF-BB对低氧大鼠远端PVSMCCaSR、TRPC6表达的影响
常氧(21% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，大鼠远端PVSMC的CaSR和TRPC6蛋白表达水平与对照组比较均显著升高；而慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB处理大鼠远端PVSMC48h后，PVSMC的CaSR和TRPC6蛋白表达水平与对照组比较均显著升高。
2、CaSR激动剂及阻滞剂对PDGF-BB促低氧PVSMC增殖的影响
慢性低氧(4% O2)条件下，15ng/mL的PDGF-BB孵育大鼠远端PVSMC，加用CaSR激动剂(2μM精胺)作用细胞48h后，大鼠远端PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著升高。相反，加用CaSR阻滞剂(5μMNPS2143)作用细胞48h后，大鼠远端PVSMC的细胞数、细胞活力及处于S期的细胞比例与对照组比较均显著下降。
3、慢性低氧与PDGF-BB作用下，大鼠远端PVSMCCaSR与TRPC6的调控关系及对PVSMC细胞增殖的影响
(1)CaSR特异性siRNA(siCaSR)对PDGF-BB促低氧PVSMC的TRPC6表达及细胞增殖的影响
慢性低氧和PGDF-BB作用下，siCaSR对大鼠远端PVSMCTRPC6的蛋白水平表达呈抑制作用，且siCaSR显著抑制低氧和PDGF-BB作用下引起的大鼠远端PVSMC的细胞数升高、细胞活力增强及处于S期的细胞比例的升高。
(2)TRPC6特异性siRNA(siTRPC6)对PDGF-BB促低氧PVSMC的CaSR表达及细胞增殖的影响
慢性低氧和PGDF-BB作用下，siTRPC6对大鼠远端PVSMCCaSR的蛋白水平表达均无影响，但是siTRPC6显著抑制低氧和PDGF-BB作用下引起的大鼠远端PVSMC的细胞数升高、细胞活力增强及处于S期的细胞比例的升高。
【实验结论】
1、VEGF对大鼠远端PVSMC增殖无影响，EGF和PDGF-BB能促进大鼠远端PVSMC增殖，PDGF-BB对PVSMC促增殖作用在慢性低氧条件下更强。
2、PDGF-BB通过CaSR和TRPC6参与促进低氧大鼠远端PVSMC增殖。